6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，從而制備pGXIO/tFpGXIO/ tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C。通過(guò)用ΚρηΙ和Xbal酶處理pG)(10/tF，分 離出tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，用Nhel和Xbal酶處理pGXIO后，用連 SIi3i^l6E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C, pGX2 7 / tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C(以下均稱〃GX-188E")。
[0062]〈實(shí)施例2>GX-188E對(duì)宮頸癌的治療效果的證實(shí) 為確認(rèn)GX-188E對(duì)宮頸癌的治療效果，對(duì)C57BL/6小鼠皮下注射5X105個(gè)TC-1腫瘤細(xì) 胞，在注射后的第3天和第8天肌肉注射50yg及100yg量的GX-188E，然后進(jìn)行電穿孔法。從注 射腫瘤細(xì)胞起的第27天為止觀察腫瘤細(xì)胞的體積變化，在第36天去除小鼠的脾，然后將IX 1〇6個(gè)細(xì)胞與IL-2及HPV16的E6CD8T細(xì)胞表位(抗原決定基，epitope) (E648-57;EVYDFAFRDL， P印tron，韓國(guó)）或HPV18 的E7CD8T細(xì)胞表位(E749-57;RAHYNIVTF，P印tron，韓國(guó)）或HPV18 的E6 肽池(peptidepool)或HPV18的E7肽池一起置于已用50μ1的5yg/ml的抗鼠IFN-g抗體(BD Pharmigen，Sandiego，加州）包被的平板中并在37°C和5 %C〇2的培養(yǎng)箱（Froma，Minnesota， 美國(guó)）中培養(yǎng)24小時(shí)。用PBST洗滌所述平板后，向其中分別加入50μ1的2yg/ml的含有懸垂生 物素的IFN-g檢測(cè)抗體(BDPharmigen，Sandiego,加州）并在常溫下培養(yǎng)約3小時(shí)。之后，用 PBST洗滌，其中加入50yg的已稀釋至1:2000的鏈霉抗生物素蛋白-AKP(堿性磷酸酶)并在常 溫下培養(yǎng)約1小時(shí)。用PBST洗滌后，分別加入50μ1的在10ml的堿性磷酸鹽緩沖液中的66μ1的 NBT(Promega，Madison，WI)與33μ1 的BCIP(Promega,Madison，WI)的混合物，以使其相互反 應(yīng)。將平板置于37°C培養(yǎng)箱中約30分鐘，然后用蒸餾水(D.W.)洗滌并用計(jì)數(shù)器對(duì)所生成的 斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0063]與用作為對(duì)照組的pGX27處理過(guò)的小鼠相比，可確認(rèn)用GX-188E對(duì)TC-1腫瘤細(xì)胞治 療過(guò)的小鼠的腫瘤體積明顯減小(請(qǐng)參照?qǐng)D5)。
[0064] 產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性 本發(fā)明的融合蛋白可用于由HPV引起的腫瘤的治療劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 編碼融合多肽的多核苷酸，其特征在于，所述融合多肽用于轉(zhuǎn)換源自人乳頭瘤病毒 16及18型并具有如SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的E6和E7的三維(3D)結(jié)構(gòu)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，進(jìn)一步包括編碼免疫增強(qiáng)肽的核酸序 列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述免疫增強(qiáng)肽選自CD40配體、fms樣 酪氨酸激酶3(Flt3)配體和鞭毛蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼免疫增強(qiáng)肽的核酸序列包括 如SEQIDNO:6所示的核酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼信號(hào)肽的核酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述信號(hào)肽選自組織型纖溶酶原激活 物(tPa)信號(hào)肽、單純皰疹病毒糖蛋白Ds(HSVgDs)信號(hào)肽和生長(zhǎng)激素信號(hào)肽。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼信號(hào)肽的核酸序列包含如 SEQIDNO:5所示的核酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，其經(jīng)過(guò)密碼子最優(yōu)化。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，其包含如SEQIDN0:4所示的核酸序 列。10. -種多核苷酸，包含:編碼對(duì)應(yīng)于人乳頭瘤病毒(HPV) 16分型的E6蛋白的第1個(gè)-第 85個(gè)氨基酸的氨基酸序列的核酸序列，編碼對(duì)應(yīng)于HPV-16分型的E7蛋白的第1個(gè)-第65個(gè)氨 基酸序列的核酸序列，編碼對(duì)應(yīng)于HPV-16分型的E6蛋白的第71個(gè)-第158個(gè)氨基酸序列的核 酸序列，編碼對(duì)應(yīng)于HPV-16分型的E7蛋白的第51個(gè)-第98個(gè)氨基酸序列的核酸序列，編碼對(duì) 應(yīng)于HPV-18分型的E6蛋白的第1個(gè)-第85個(gè)氨基酸序列的核酸序列，編碼對(duì)應(yīng)于HPV-18分型 的E7蛋白的第1個(gè)-第65個(gè)氨基酸序列的核酸序列，編碼對(duì)應(yīng)于HPV-18分型的E6蛋白的第71 個(gè)-第158個(gè)氨基酸序列的核酸序列，以及編碼對(duì)應(yīng)于HPV-18分型的E7蛋白的第51個(gè)-第105 個(gè)氨基酸序列的核酸序列。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼免疫增強(qiáng)肽的核酸 序列。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼信號(hào)肽的核酸序 列。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼信號(hào)肽的核酸序 列。14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，其經(jīng)過(guò)密碼子最優(yōu)化。15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼免疫增強(qiáng)肽的核酸序列經(jīng) 過(guò)密碼子最優(yōu)化。16. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼信號(hào)肽的核酸序列經(jīng) 過(guò)密碼子最優(yōu)化。17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，其包含SEQIDN0:4，SEQIDN0:5 和SEQIDNO:6的核苷酸序列。18. 包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的載體。19. 包含如權(quán)利要求10所述的多核苷酸的載體。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的載體，其特征在于，所述載體為質(zhì)粒。21. 包含如權(quán)利要求18所述載體的宿主細(xì)胞。22. 包含如權(quán)利要求19所述載體的宿主細(xì)胞。23.-種融合蛋白，包含用于轉(zhuǎn)換源自人乳頭瘤病毒16及18型并具有如SEQ ID NO: 1所 示氨基酸序列的E6和E7的三維(3D)結(jié)構(gòu)的融合多肽。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，進(jìn)一步包含免疫增強(qiáng)肽。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫增強(qiáng)肽選自CD40配體、fms 樣酪氨酸激酶3(Flt3)配體和鞭毛蛋白。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫增強(qiáng)肽包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其特征在于，進(jìn)一步包含信號(hào)肽。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的融合蛋白，其特征在于，所述信號(hào)肽選自組織型纖溶酶原激 活物(tPa)信號(hào)肽、單純皰疹病毒糖蛋白Ds(HSV gDs)信號(hào)肽和生長(zhǎng)激素信號(hào)肽。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的融合蛋白，其特征在于，所述信號(hào)肽包含如SEQ ID N0:2所 示的氨基酸序列。30.-種融合蛋白，包含:對(duì)應(yīng)于人乳頭瘤病毒(HPV) 16分型的E6蛋白的第1個(gè)-第85個(gè) 氨基酸的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于HPV-16分型的E7蛋白的第1個(gè)-第65個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于 HPV-16分型的E6蛋白的第71個(gè)-第158個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于HPV-16分型的E7蛋白的第51 個(gè)-第98個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于HPV-18分型的E6蛋白的第1個(gè)-第85個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于 HPV-18分型的E7蛋白的第1個(gè)-第65個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于HPV-18分型的E6蛋白的第71個(gè)-第158個(gè)氨基酸序列，以及對(duì)應(yīng)于HPV-18分型的E7蛋白的第51個(gè)-第105個(gè)氨基酸序列。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的融合蛋白，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼免疫增強(qiáng)肽的氨基 酸序列。32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的融合蛋白，其特征在于，進(jìn)一步包含編碼信號(hào)肽的氨基 酸序列。33.用于在有需要的個(gè)體中預(yù)防或治療HPV引發(fā)的疾病的組合物，包含如權(quán)利要求1所 述的多核苷酸、如權(quán)利要求10所述的多核苷酸、如權(quán)利要求18所述的載體、如權(quán)利要求19所 述的載體、如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞、如權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞、如權(quán)利要求23所 述的融合蛋白或如權(quán)利要求30所述的融合蛋白。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于，所述HPV引發(fā)的疾病為宮頸癌。35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于，進(jìn)一步包括藥學(xué)允許的載體。36.表達(dá)融合蛋白的方法，包括:將如權(quán)利要求1或10所述的多核苷酸轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療包括人乳頭瘤病毒變形體及免疫增強(qiáng)劑的宮頸癌的組合物。更具體地，融合蛋白通過(guò)誘導(dǎo)HPV16及18型抗原特異性免疫應(yīng)答治療由HPV引起的腫瘤，所述融合蛋白包括：融合多肽，該融合多肽被重組以使人乳頭瘤病毒16及18型的抗原E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形；信號(hào)肽，該信號(hào)肽用于分泌所述融合多肽；和免疫增強(qiáng)肽。
【IPC分類】C12N15/62, A61K48/00, C07K19/00, C07K14/025, A61K38/16, C07K14/435, C12N15/79, A61P35/00, A61K39/12
【公開(kāi)號(hào)】CN105463000
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510981991
【發(fā)明人】成永喆, 徐相煥, 徐裕錫
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社吉耐森
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2010年8月13日