聚合酶 0.4 yl，cDNA 模板 2μ1，上下游引物各 1 μL， 后加 ddH20補足5〇μ1。
[0018] PCR反應條件分別為： 第一輪：94 °C預變性3min ;94 °C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)35次， 循環(huán)結束后再72 °C延伸10 min。
[0019] 第二輪：94 °C預變性 3min ;94 °C變性 30s，47°C退火 30s，72°C延伸 45s，循環(huán) 35 次，循環(huán)結束后再72 °C延伸10 min。
[0020] 所得PCR產物，部分經1. 5 %瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后紫外線下觀察并拍 照，剩余部分送上海金斯瑞有限公司純化并測序。參見圖1。
[0021] 4、序列處理及分析 獲得的DNA序列先提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，然后利用"BLAST"工具（NCBI站點）進 行相似性檢索，并確定片段方向；用GenDoc軟件進行序列同源性比較；用MEGA5. 0軟件，計 算各物種間的遺傳距離，轉換和顛換值及其比值（R值)，保守位點（conserved sites C)及 變異位點（variable sites V)等數(shù)值，用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0022] 5、mtDNACOI基因的組成及分子進化特征 將自測的5個天牛的C0I序列進行校對，并同網上下載序列進行對齊、剪切后得到 481bp 的序列。在 NCBI (National Center of Biotechnolgoy Infarmtion)數(shù)據(jù)庫進行序 列相似性搜索，經BLAST檢索后證明所得序列均為C0I基因序列。
[0023] 應用Mega5. 0軟件對天牛C0I基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在481個位點中保守位點 90個，變異位點391個，信息位點375個，自裔位點16個。所有位點中，A、T、C、G的平均含 量分別為：29· 6%、35· 8%、18. 5%、16. 1%。A+T含量較高，為65. 4%，明顯高于G + C含量，表現(xiàn) 明顯的A + T堿基偏嗜，且A與T含量相當，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。
[0024] 6、堿基替換分析 應用Mega5. 0軟件對天牛C0I基因序列的替換數(shù)進行估計，從統(tǒng)計結果可以看出：33 種天牛C0I基因 481個核苷酸序列中，所有轉換（si)與顛換（sv)的比值為0. 84,密碼子 第一位點的轉換與顛換的比值分別是0.83,密碼子第二位點的轉換與顛換的比值分別是 0.72,可以看出轉換沒有顛換頻繁。密碼子第3位點最為保守，轉換和顛換率均較低。（表3 所示） 表3天牛C0I基因堿基替換統(tǒng)計表 7、遺傳距尚分析 基于Kimure2_parameter模型分析33種天牛COI的遺傳距離，米用Bootstrap (1000 次）進行檢驗，如圖3所示。斷眼天牛屬3種天牛種間的遺傳距離介于0. 052~ 0. 087間； 其余天牛種間的遺傳距離介于〇.〇75~ 0.292間，說明33種天牛C0I間的分化，個別種間的 差異相對較大，可通過分子手段進行區(qū)分、鑒定。
[0025] 8、分子進化樹的構建 基于C0I基因序列數(shù)據(jù)，用Mega5. 0軟件選擇Kimura 2-parameter遺傳距離模型，同 時采用Bootstrap重復抽樣1000次循環(huán)，計算系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平，構建鄰接法 (NJ)分子系統(tǒng)樹。結果如圖4,從圖4可以看出，C0I序列構建的系統(tǒng)進化樹，可以將大部 分天牛種群進行區(qū)分，Tetropium屬、Monochamus屬種群聚集為一支，總體上系統(tǒng)發(fā)育樹支 持了形態(tài)學上鑒定的屬和大部分種的地位，另一方面也說明構建基因條碼的可行性。
【主權項】
1. 一種天?？朴紫x不同家系的分子標記方法，其特征在于，采用以下步驟實現(xiàn)： 1) 選用兩對特異性引物進行PCR反應，所述兩對特異性引物為 上游引物J173 :5' -TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' 下游引物J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' ； 上游引物J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' 下游引物N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 2) 從待測不同家系的天牛個體及親本，采用DNA提取法提取基因組DNA; 3) 用步驟2)的基因組DNA為模板，步驟1)所選的兩對引物分別進行兩輪PCR擴增； 4) 對步驟3)的PCR產物用1.5 %瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后紫外線下觀察并拍 照電泳結果，剩余部分送上海金斯瑞有限公司純化并測序； 5) 獲得的DNA序列先提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，然后利用BLAST工具進行相似性檢 索，并確定片段方向；用GenDoc軟件進行序列同源性比較；用MEGA5. 0軟件，計算各物種間 的遺傳距離，轉換和顛換值及其比值，保守位點及變異位點等數(shù)值，用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育 樹，根據(jù)個體間的遺傳距離聚類結果，區(qū)分來自不同家系的個體。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種天牛科幼蟲不同家系的分子標記方法，其特征在于，在 步驟3)中，在進行PCR擴增時，PCR反應體系采用50μ1標準反應體系，其中含有10XPCR Buffer(Mg2+) 5μ1，2. 5mmol/L的dNTPs4μ1，T^DNA聚合酶 0· 4μ1，cDNA模板 2μ1,上下游引物各1μ1,后加ddH20補足5〇μ1。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種天?？朴紫x不同家系的分子標記方法，其特征在于，在 步驟3)中，第一輪PCR反應的條件為：94°C預變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸lmin，循環(huán)35次，循環(huán)結束后再72°C延伸10min。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種天牛科幼蟲不同家系的分子標記方法，其特征在于，在 步驟3)中，第二輪PCR反應的條件為：94°C預變性3min;94°C變性30s，47°C退火30s， 72°C延伸45s，循環(huán)35次，循環(huán)結束后再72°C延伸10min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種天?？朴紫x不同家系的分子標記方法，采用以下步驟實現(xiàn)：選用兩對特異性引物進行PCR反應，從待測不同家系的天牛個體及親本，采用DNA提取法提取基因組DNA；用基因組DNA為模板，所選的兩對引物分別進行兩輪PCR擴增；PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后紫外線下觀察并拍照電泳結果；用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。本發(fā)明對33種天牛COI基因的遺傳距離表明：不同屬間遺傳距離明顯大于同屬間遺傳距離，COI基因完全符合DNA條形碼有效性的檢驗標準，該片段可以較好的區(qū)分天牛的不同屬的不同種類，可用于天?？频目焖勹b定。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105441532
【申請?zhí)枴緾N201410506471
【發(fā)明人】顧忠盈, 呂飛
【申請人】中華人民共和國太倉出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月28日