一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法
【專利說(shuō)明】一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0003]青色熒光蛋白(CFP)是一種發(fā)光蛋白GFP的一個(gè)突變體，與gfp的區(qū)別只是最大激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光的波長(zhǎng)不同，發(fā)青色熒光，常被用于生物領(lǐng)域的報(bào)告基因。將CFP導(dǎo)入待標(biāo)記的菌株或細(xì)胞中，可直接觀察發(fā)光狀況。其熒光表達(dá)和遺傳特性穩(wěn)定，熒光檢測(cè)方便且不會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生不良影響。應(yīng)用熒光顯微鏡可以對(duì)標(biāo)記菌和宿主進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。用于熒光觀察的儀器主要有紫外燈、熒光比色儀、熒光正置或倒置顯微鏡、體式熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等。用紫外燈照射菌落或菌液，可直接觀察熒光菌發(fā)出的熒光，可以快捷的平板計(jì)數(shù);熒光顯微鏡適合對(duì)標(biāo)記菌切片進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)地檢測(cè);共聚焦激光掃描顯微鏡具有高分辨率及三維成像功能。體式熒光顯微鏡可得到三維立體圖像，無(wú)需制作切片，可直接觀察。關(guān)于上述檢測(cè)方法的應(yīng)用較多，但將體式熒光顯微鏡與紫外燈結(jié)合共同對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的應(yīng)用較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，是在青色熒光CFP標(biāo)記目標(biāo)根瘤菌后，于苜蓿生殖生長(zhǎng)期內(nèi)取樣，再進(jìn)行平板數(shù)量檢測(cè)和體式熒光顯微鏡檢測(cè)。
[0006]進(jìn)一步的，上述的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
1)取樣:分別于苜蓿生殖生長(zhǎng)期的蕾期、初花期、結(jié)莢期，采用根部澆灌、切根澆灌、添加苦參堿菌液澆灌和花部噴射4種接種方法接種青色熒光CFP標(biāo)記的目標(biāo)根瘤菌，于接種后的5d、15d、30d、60d取樣檢測(cè)分析，直至種子收獲;其中:取苜蓿單株，隨機(jī)分離出5-lOcm深土層的毛根、側(cè)根皮層、側(cè)根中柱;莖、葉均隨機(jī)取自同一植株，且分離為上部莖、下部莖、上部葉和下部葉、花絲、花瓣、胚珠、花柱、柱頭、花藥、莢果皮和種子;取樣用自來(lái)水沖洗干凈后自然晾干；
2)平板數(shù)量檢測(cè):在無(wú)菌環(huán)境下，分別將各部位取樣品稱取lg，花5朵/花序、莢果皮5個(gè)/花序、種子5粒/花序，放入50ml無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入2500mg/L放入碘伏消毒液淹沒(méi)，震蕩消毒4min后無(wú)菌水沖洗5次，至三角瓶?jī)?nèi)無(wú)泡沫狀液體出現(xiàn);將完全消毒的組織分別置于無(wú)菌研缽中，加入2ml無(wú)菌水充分研磨后離心，離心時(shí)間為5min，轉(zhuǎn)速為4000rpm/min，吸取
0.2ml上清液均勻涂布于根研磨液依次稀釋lOllO3的TY固體培養(yǎng)基，重復(fù)三次，28°C培養(yǎng)24h后，觀察每皿內(nèi)熒光標(biāo)記菌數(shù)量，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)采用SC6+安菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；
3)體式熒光顯微鏡檢測(cè):黑白體式熒光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測(cè)中，含CFP標(biāo)記根瘤菌的苜蓿組織為白色，未檢出的組織為黑色；顯微鏡檢測(cè)取樣方法與步驟2)平板數(shù)量檢測(cè)方法相同，采用體式熒光顯微鏡檢測(cè)，綠光激發(fā)，濾片F(xiàn)S47，將樣品置于體式熒光顯微鏡載物臺(tái)上觀察照相。
[0007]進(jìn)一步的，上述的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，所述TY培養(yǎng)基的組成及制備方法為:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl2.6H2O 1.3g/L、瓊脂15g/L，pH 至 7.0，121°C 滅菌 26min。
[0008]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
1)手提紫外燈操作簡(jiǎn)單，結(jié)果容易觀察；
2)取樣、分離后表面滅菌消毒的各器官無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)研磨、涂抹，手提紫外燈可以計(jì)數(shù)發(fā)光根瘤菌數(shù)量;取樣簡(jiǎn)單，檢測(cè)方法方便，研磨過(guò)程輕松較快，兩種檢測(cè)方法結(jié)合更加準(zhǔn)確判斷根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移及定殖狀況；
3)取樣、分離后的苜蓿器官表面消毒后可實(shí)時(shí)應(yīng)用黑白體式熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，SP可得到三維立體照片，無(wú)需制作切片，可直接觀察。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為紫外燈(336nm)檢測(cè)結(jié)莢期切根澆灌側(cè)根中柱(A)、側(cè)根皮層(B)和毛根(C)內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量。
[0010]圖2為體式熒光顯微鏡下觀察根部熒光標(biāo)記根瘤菌定殖，其中A毛根;B皮層;(:中柱。
[0011]圖3為體式熒光顯微鏡下觀察花期根部澆灌花(A)和紫外燈下(336nm)檢測(cè)切根澆灌莢果皮(B)內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌定殖。
[0012]圖4為體式熒光顯微鏡下觀察蕾期苦參堿菌液澆灌下部莖(A)和根部澆灌下部葉(B)內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌定殖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1:
一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，是在青色熒光CFP標(biāo)記目標(biāo)根瘤菌后，于苜蓿生殖生長(zhǎng)期內(nèi)取樣，再進(jìn)行平板數(shù)量檢測(cè)和體式熒光顯微鏡檢測(cè)，其具體過(guò)程包括以下步驟:
1)取樣:分別于苜蓿生殖生長(zhǎng)期的蕾期、初花期、結(jié)莢期，采用根部澆灌、切根澆灌、添加苦參堿菌液澆灌和花部噴射4種接種方法接種青色熒光CFP標(biāo)記的目標(biāo)根瘤菌，于接種后的5d、15d、30d、60d取樣檢測(cè)分析，直至種子收獲;其中:取苜蓿單株，隨機(jī)分離出5-lOcm深土層的毛根、側(cè)根皮層、側(cè)根中柱;莖、葉均隨機(jī)取自同一植株，且分離為上部莖、下部莖、上部葉和下部葉、花(花絲、花瓣、胚珠、花柱、柱頭、花藥)、莢果皮和種子;取樣用自來(lái)水沖洗干凈后自然晾干。
[0014]2)平板數(shù)量檢測(cè):在無(wú)菌環(huán)境下，將收取的苜蓿各組織根、莖、葉樣品，各稱取lg，花5朵/花序、莢果皮5個(gè)/花序、種子5粒/花序，放入50ml無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入碘伏消毒液淹沒(méi)，使有效碘濃度為2500 mg/L，震蕩消毒4min后無(wú)菌水沖洗5次，至三角瓶?jī)?nèi)無(wú)泡沫狀液體出現(xiàn)即可;將完全消毒的組織分別置于無(wú)菌研缽中，加入2ml無(wú)菌水充分研磨后離心，離心時(shí)間為5min，轉(zhuǎn)速為4000rpm/min，吸取0.2ml上清液均勾涂布于根研磨液依次稀釋lOllO3的TY固體培養(yǎng)基，重復(fù)三次，28°C培養(yǎng)24h后，觀察每皿內(nèi)熒光標(biāo)記菌數(shù)量，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)采用SC6+安菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)?？梢杂^察到各時(shí)期各分離部位均可以檢測(cè)出熒光標(biāo)記根瘤菌，地下各器官內(nèi)數(shù)量高于地上器官。地下以蕾期根部澆灌毛根內(nèi)定殖數(shù)量最多，高達(dá)8.22X 105cfu/g。地上部各器官內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量因接種時(shí)期不同而不同，蕾期主要定殖于營(yíng)養(yǎng)器官，加入苦參堿菌液澆灌接種下部莖內(nèi)數(shù)量最高，達(dá)43.30 cfu/g;花期主要定殖于花器內(nèi)，花部噴射處理花藥與莢果皮內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量最高，均達(dá)8.0Ocf u/花序;結(jié)莢期主要定殖于結(jié)果內(nèi)，切根澆灌接種莢果皮內(nèi)數(shù)量最高，達(dá)2.20 cfu/花序。
[0015]3)體式熒光顯微鏡檢測(cè):黑白體式熒光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測(cè)中，含CFP標(biāo)記根瘤菌的苜蓿組織為白色，未檢出的組織為黑色；顯微鏡檢測(cè)取樣方法與步驟2)平板數(shù)量檢測(cè)方法相同，采用體式熒光顯微鏡檢測(cè)，綠光激發(fā)，濾片F(xiàn)S47，將樣品置于體式熒光顯微鏡載物臺(tái)上觀察照相。發(fā)現(xiàn)苜蓿根、莖、葉及莢果內(nèi)均可以檢測(cè)到發(fā)光的熒光標(biāo)記根瘤菌。
[0016]4)圖1-圖4顯示為紫外燈及體式熒光顯微鏡下觀察部分植株器官內(nèi)熒光標(biāo)記根瘤菌定殖狀況。
[0017]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，其特征在于，是在青色熒光CFP標(biāo)記目標(biāo)根瘤菌后，于苜蓿生殖生長(zhǎng)期內(nèi)取樣，再進(jìn)行平板數(shù)量檢測(cè)和體式熒光顯微鏡檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: .1)取樣:分別于苜蓿生殖生長(zhǎng)期的蕾期、初花期、結(jié)莢期，采用根部澆灌、切根澆灌、添加苦參堿菌液澆灌和花部噴射4種接種方法接種青色熒光CFP標(biāo)記的目標(biāo)根瘤菌，于接種后的5d、15d、30d、60d取樣檢測(cè)分析，直至種子收獲;其中:取苜蓿單株，隨機(jī)分離出5-lOcm深土層的毛根、側(cè)根皮層、側(cè)根中柱;莖、葉均隨機(jī)取自同一植株，且分離為上部莖、下部莖、上部葉和下部葉、花絲、花瓣、胚珠、花柱、柱頭、花藥、莢果皮和種子;取樣用自來(lái)水沖洗干凈后自然晾干； .2)平板數(shù)量檢測(cè):在無(wú)菌環(huán)境下，分別將各部位取樣品稱取lg，花5朵/花序、莢果皮5個(gè)/花序、種子5粒/花序，放入50ml無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入2500mg/L的碘伏消毒液淹沒(méi)，震蕩消毒4min后無(wú)菌水沖洗5次，至三角瓶?jī)?nèi)無(wú)泡沫狀液體出現(xiàn);將完全消毒的組織分別置于無(wú)菌研缽中，加入2ml無(wú)菌水充分研磨后離心，離心時(shí)間為5min，轉(zhuǎn)速為4000rpm/min，吸取.0.2ml上清液均勻涂布于根研磨液依次稀釋lOllO3的TY固體培養(yǎng)基，重復(fù)三次，28°C培養(yǎng).24h后，觀察每皿內(nèi)熒光標(biāo)記菌數(shù)量，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)采用SC6+安菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)； .3)體式熒光顯微鏡檢測(cè):黑白體式熒光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測(cè)中，含CFP標(biāo)記根瘤菌的苜蓿組織為白色，未檢出的組織為黑色；顯微鏡檢測(cè)取樣方法與步驟2)平板數(shù)量檢測(cè)方法相同，采用體式熒光顯微鏡檢測(cè)，綠光激發(fā)，濾片F(xiàn)S47，將樣品置于體式熒光顯微鏡載物臺(tái)上觀察照相。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述TY培養(yǎng)基的組成及制備方法為:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl2.6H2O.1.3g/L、瓊脂15g/L，pH至7.0，121°C滅菌26min。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，是在青色熒光CFP標(biāo)記目標(biāo)根瘤菌后，于苜蓿生殖生長(zhǎng)期取樣，再進(jìn)行平板數(shù)量檢測(cè)和體式熒光顯微鏡檢測(cè)。本發(fā)明提供的一種苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖目標(biāo)根瘤菌的檢測(cè)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）手提紫外燈操作簡(jiǎn)單，結(jié)果容易觀察；2）取樣、分離后表面滅菌消毒的各器官無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)研磨、涂抹，手提紫外燈可以計(jì)數(shù)發(fā)光根瘤菌數(shù)量；取樣簡(jiǎn)單，檢測(cè)方法方便，研磨過(guò)程輕松較快，兩種檢測(cè)方法結(jié)合更加準(zhǔn)確判斷根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運(yùn)移及定殖狀況；3）取樣、分離后的苜蓿器官表面消毒后可實(shí)時(shí)應(yīng)用黑白體式熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，即可得到三維立體照片，無(wú)需制作切片，可直接觀察。
【IPC分類】C12Q1/06, C12Q1/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105441526
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510891374
【發(fā)明人】師尚禮, 苗陽(yáng)陽(yáng)
【申請(qǐng)人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日