基于InDel標(biāo)記的常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物鑒別技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于InDel標(biāo)記的常規(guī)稻品種淮稻5號(hào) 和淮稻18號(hào)的鑒定方法，即一種利用水稻DNA插入或缺失分子標(biāo)記鑒定常規(guī)稻品種淮稻5 號(hào)和淮稻18號(hào)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 栽培稻（OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，具有豐富的遺傳多 樣性。水稻品種鑒定對(duì)于水稻遺傳研究和品種培育具有重要意義。已經(jīng)報(bào)道的鑒定水稻品 種的方法多為粳稻和秈稻亞種的鑒定，如以形態(tài)鑒定為基礎(chǔ)的"程氏指數(shù)法"（包括六個(gè)性 狀：稃毛、酚反應(yīng)、穗節(jié)長(zhǎng)、稻殼色、葉毛和谷粒長(zhǎng)寬比）和基于分子標(biāo)記的粳稻-秈稻鑒定 方法等。對(duì)某一具體品種是否為特定的水稻品種進(jìn)行鑒定的方法則限于SNP芯片的一種方 法，但SNP芯片價(jià)格昂貴，分析周期較長(zhǎng)，后續(xù)的數(shù)據(jù)處理繁瑣，不能當(dāng)天得到檢測(cè)結(jié)果。
[0003] 淮稻5號(hào)系江蘇省徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)科所選育而成，是一個(gè)集高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)于一 體的遲熟中粳稻新品種。2000年通過(guò)江蘇省審定，審定編號(hào)為蘇種審字第358號(hào)。該品種 株型較緊湊，莖桿粗壯抗倒。葉片挺立。分蘗性中上等，最高莖蘗數(shù)28萬(wàn)/畝。莖蘗生長(zhǎng)整 齊，成穗率高達(dá)80%以上。穗粒協(xié)調(diào)，一般每畝成穗數(shù)22萬(wàn)，每穗總粒數(shù)為110 - 130粒， 結(jié)實(shí)率90%以上，千粒重28克左右。對(duì)白葉枯病、稻瘟病、紋枯病均表現(xiàn)良好的抗性，稻曲 病輕。全生育期150天左右，與武育粳3號(hào)相仿。后期轉(zhuǎn)色好，熟色熟相倶佳，較難脫粒。米 質(zhì)優(yōu)良，米飯潔白有光澤，口感好。適合我省淮南地區(qū)中上等肥力條件下種植。
[0004] 淮稻18號(hào)由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所和淮陰師范學(xué)院以淮66/徐23121 雜交，于2010年育成，屬遲熟中粳稻品種。適宜江蘇省蘇中地區(qū)及寧鎮(zhèn)揚(yáng)丘陵地區(qū)種植。該 品種株型緊湊，長(zhǎng)勢(shì)較旺，穗型中等，分蘗力較強(qiáng)，葉色中綠，后期灌漿快，熟色好，抗倒性較 強(qiáng)；省區(qū)試平均結(jié)果：每畝有效穗22. 4萬(wàn)，每穗實(shí)粒數(shù)114. 1粒，結(jié)實(shí)率93. 8%，千粒重28. 3 克，株高96. 0厘米，全生育期154. 6天，比對(duì)照淮稻9號(hào)遲熟2天。病害鑒定：穗頸瘟損失 率3級(jí)、穗頸瘟綜合抗性指數(shù)4. 25,中感白葉枯病，抗紋枯病、條紋葉枯病，米質(zhì)理化指標(biāo)經(jīng) 農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量檢測(cè)中心2014年檢測(cè)：整精米率73. 7%，堊白率11%，堊白度3. 2%，膠稠度 69毫米，直鏈淀粉含量18. 2%，達(dá)到國(guó)標(biāo)三級(jí)優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 淮稻5號(hào)和淮稻18遺傳背景相似，可能在生產(chǎn)中產(chǎn)生品種混淆，用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定 方法時(shí)間周期長(zhǎng)，出錯(cuò)機(jī)率高，有必要建立基于基因型的快速鑒定方法。
[0006]InDel標(biāo)記（insertion-deletionlengthpolymorphism)，也叫插入缺失長(zhǎng)度多 態(tài)性，是由于堿基序列的相對(duì)插入或者缺失造成的，在基因組中分布廣泛，長(zhǎng)度從一個(gè)核苷 酸到幾百甚至幾萬(wàn)不等。對(duì)InDel標(biāo)記臨側(cè)保守的序列設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚 丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示InDel位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性，從而達(dá)到鑒定的目的。與 應(yīng)用較廣的SSR標(biāo)記相比，InDel標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)數(shù)量十分豐富，廣泛分布于各條 染色體上；（2)是共顯性標(biāo)記，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；（3)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，易于操作，技術(shù)重復(fù)性 好，結(jié)果可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)觀察難區(qū)分品種差異的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于 InDel標(biāo)記的常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)的鑒定方法，通過(guò)開(kāi)發(fā)的24對(duì)特異性引物用 以鑒定常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)，旨在快速鑒定某特定品種是否為新培育的優(yōu)質(zhì)常 規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)，對(duì)待鑒定品種進(jìn)行基因組DNA的提取，使用本研究報(bào)道的 特定引物對(duì)組合對(duì)其進(jìn)行PCR，然后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色，當(dāng)天即可得到品 種的鑒定結(jié)果，高效、準(zhǔn)確、可靠。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：利用粳稻品種日本晴與秈稻品種93-11的全 基因組DNA序列的比對(duì)而獲得插入/缺失差異片段所設(shè)計(jì)的24對(duì)特異DNA引物，對(duì)淮稻5 號(hào)和淮稻18號(hào)進(jìn)行DNA提取、DNA片段擴(kuò)增和電泳分離以及電泳圖譜的分析來(lái)鑒定淮稻5 號(hào)和淮稻18號(hào)品種；具體而言，利用24對(duì)InDel引物組合，對(duì)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和凝膠 垂直板電泳獲得的指紋圖譜進(jìn)行分析，根據(jù)24個(gè)InDel位點(diǎn)的電泳帶型，進(jìn)而確定是否是 常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)；其特征是：基于InDel標(biāo)記的常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮 稻18號(hào)的鑒定用InDel特異引物對(duì)對(duì)應(yīng)如下列表所述：
上述基于InDel標(biāo)記的常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)的鑒定方法包括步驟如下： 步驟一、選取水稻植株的任何器官或組織提取總DNA ; 步驟二、用引物對(duì)擴(kuò)增步驟一所述DNA ; 步驟三、對(duì)步驟二所述擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，24個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果完全一致，則為 常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)。
[0009] 其中，步驟一中，所述提取總DNA具體是指用CTAB法提取核基因組DNA。
[0010] 其中，步驟二中，所述擴(kuò)增體系：20yL，包括30-50ng的模板的DNA，0. 25個(gè)單位的 DNA聚合酶（申能博彩），2.0yL的lOXBuffer(含Mg2+)，2.0mMdNTPs2yL; 所述擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，32個(gè)循 環(huán)；最后72°C延伸7min。 toon] 其中，步驟三中，凝膠電泳分析具體為：加入適量上樣緩沖液于步驟二所述擴(kuò)增的 產(chǎn)物中，在22V/cM恒定電場(chǎng)強(qiáng)度下，經(jīng)12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳100分鐘后，銀染顯 色；含有水稻DNA的樣品在前述24對(duì)引物組合時(shí)，能分別在不同位點(diǎn)（引物對(duì)）上擴(kuò)增出現(xiàn) 明顯的多態(tài)性帶型（下面的兩條主帶和上面的重組帶)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果： 1、 利用水稻全基因組特異位點(diǎn)上的InDel片段差異設(shè)計(jì)的特異引物，秈-粳雜合帶型 來(lái)鑒定常規(guī)稻淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)，方法簡(jiǎn)便，樣品用量少，準(zhǔn)確性高，速度快； 2、 基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，利用秈-粳稻24個(gè)位點(diǎn)上的InDel片段序列差異和PCR反應(yīng)的 快速高效性，在短時(shí)間內(nèi)能精確鑒定常規(guī)稻品種淮稻5號(hào)和淮稻18號(hào)，方法簡(jiǎn)便、快捷，有 很好的應(yīng)用推廣前景； 3、 對(duì)InDel標(biāo)記旁鄰保守的序列設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電 泳，即可顯示InDel位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性，從而達(dá)到鑒定的目的； 4、 使用的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增體系為常規(guī)PCR體系，不需要特殊的PCR儀和特殊的反應(yīng)試 劑，任何公司生產(chǎn)的PCR儀和任何生物試劑公司生產(chǎn)的試劑均可使用而達(dá)到目的。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 通過(guò)閱讀參照附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的 和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯： 圖1為PCR電泳圖，泳道1至泳道7分別為水稻品種9311、II優(yōu)084、淮稻18號(hào)、粵泰A、粵優(yōu)938、淮稻5號(hào)、日本晴；從圖1可以看出，淮稻18號(hào)基因型主要為粳稻背景（日本 晴)，與