木瓜功能著絲?？乖嚯募捌鋺?yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物信息學(xué)與分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及木瓜功能著絲?？乖嚯募捌鋺?yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]著絲粒是高等真核生物染色體上重要的功能元件。在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中負(fù)責(zé)染色體的均等分離，從而起到確保遺傳物質(zhì)穩(wěn)定傳遞的重要作用。因此開展著絲粒方面的研究對(duì)于揭示生物體的遺規(guī)律具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。由于著絲粒功能的重要性，人們對(duì)著絲粒開展了大量的研究，在細(xì)胞學(xué)中，我們把著絲粒定義為染色體上的主縊痕區(qū)，在觀察染色體的形態(tài)時(shí)，這個(gè)區(qū)域能夠被我們清楚的看到，但是對(duì)于著絲粒的具體邊界定義較模糊，為了開展進(jìn)一步的研究，我們需要更清楚的知道著絲粒的結(jié)構(gòu)。隨著研究的深入，人們對(duì)著絲粒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一個(gè)更加精細(xì)劃分，著絲粒由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即核心結(jié)構(gòu)域和核心結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的周緣著絲粒異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，它們分別行使著絲粒的不同功能，其中核心結(jié)構(gòu)域的功能是組建動(dòng)粒，附著紡錘絲，參與染色體的迀移，行使著絲粒的主要功能，因此這一區(qū)域被人們認(rèn)為是實(shí)際的著絲粒區(qū)，人們把它稱為功能著絲粒，通過對(duì)植物功能著絲粒的研究，人們發(fā)現(xiàn)其上存在著一種功能很重要的蛋白即CENH3蛋白，它的作用是能夠募集動(dòng)粒蛋白，因此，它在染色體上存在的區(qū)域被認(rèn)為是著絲粒的區(qū)域，它也被作為識(shí)別著絲粒功能區(qū)域的特殊標(biāo)記，通過對(duì)CENH3位置與大小的研究能夠反映著絲粒的位置和大小。目前，免疫熒光技術(shù)和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)是利用CENH3抗體研究功能著絲粒最好的方法，因此，CENH3基因的鑒定及其特異識(shí)別抗體的制備也成為功能著絲粒研究不可或缺的工具。
[0003]BLAST，全稱 Basic Local Alignment Search Tool，即〃基于局部比對(duì)算法的搜索工具，它能夠根據(jù)同源性搜索，由一條序列得到與之有同源性的另一條序列，它具體包括了五種序列比對(duì)的方式:蛋白序列與蛋白庫做比對(duì)，直接比對(duì)蛋白序列的同源性；核酸序列對(duì)蛋白庫的比對(duì)，先將核酸序列翻譯成蛋白序列，然后再與蛋白庫做比對(duì)；核酸序列對(duì)核酸庫的比對(duì)，直接比較核酸序列的同源性；蛋白序列對(duì)核酸庫的比對(duì)，將庫中的核酸翻譯成蛋白序列，然后進(jìn)行比對(duì)；核酸序列對(duì)核酸庫在蛋白級(jí)別的比對(duì)，將庫和待查序列都翻譯成蛋白序列，然后對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)?；贐LAST程序的原理，根據(jù)CENH3蛋白與H3蛋白的氨基酸序列之間的同源以及差異關(guān)系，我們以H3蛋白的氨基酸序列作為查詢序列，使用BLAST程序在EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，獲得與H3蛋白在C端相似但在N端具有差異的氨基酸作為木瓜CENH3蛋白的候選核苷酸序列以及氨基酸序列。根據(jù)CENH3蛋白與H3蛋白之間的差異，選取CENH3蛋白的一段特異的氨基酸序列合成多肽制備抗體。
[0004]免疫焚光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱焚光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。通過這項(xiàng)技術(shù)，能夠驗(yàn)證我們的得到的抗體是木瓜CENH3蛋白的特異抗體，從而確定我們通過生物信息學(xué)序列比對(duì)的手段得到的木瓜CENH3蛋白的基因的核苷酸序列以及該蛋白的氨基酸序列是真實(shí)可靠的，能應(yīng)用于后續(xù)的研究。
[0005]染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatinimmunoprecipitat1n assay, ChIP)是研究生物體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法，因此，這一方法也成為功能著絲粒研究的有效手段，該方法與第二代高通量測序技術(shù)相結(jié)合(ChlP-Seq)可以在全基因組水平高效地分離、分析功能著絲粒DNA序列，目前已被廣泛應(yīng)用于功能著絲粒的研究中。
[0006]CENH3蛋白存在于木瓜染色體的功能著絲粒上的，通過制備木瓜CENH3蛋白相應(yīng)的抗體，不但能夠應(yīng)用在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，從它產(chǎn)生的熒光信號(hào)中，使我們能夠確定木瓜染色體上的功能著絲粒的位置，也能夠應(yīng)用在木瓜著絲粒的ChIP-seq的實(shí)驗(yàn)上，結(jié)合生物信息學(xué)的分析方法，得到木瓜著絲粒的具體大小和位置以及相應(yīng)的序列信息，為木瓜著絲粒的研究提供了強(qiáng)有力的支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供木瓜功能著絲?？乖嚯募捌鋺?yīng)用，獲得木瓜CENH3蛋白的基因序列和由該基因表達(dá)得到的氨基酸序列以及得到CENH3蛋白的特異抗體，然后以此抗體可以開展木瓜著絲粒方面的研究，確定木瓜著絲粒在染色體上的位置和大小以及序列信息，這有利于木瓜遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建，還有利于著絲粒形成與功能行使機(jī)制的探討，也能夠?yàn)槟竟先斯と旧w的構(gòu)建提供必需的序列信息。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
木瓜功能著絲粒抗原多肽，其氨基酸序列為MARTKKSAHKKRKPQSAAGV。根據(jù)所得到的木瓜功能著絲粒組蛋白CENH3的基因核苷酸序列得到相應(yīng)的CENH3蛋白的氨基酸序列，并根據(jù)其中的一段特異的序列人工合成所述木瓜功能著絲?？乖嚯?，以此多肽作為抗原來制備相應(yīng)的抗體。
[0009]木瓜功能著絲粒組蛋白CENH3，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。編碼所述木瓜功能著絲粒組蛋白CENH3的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0010]其抗體能夠特異與木瓜著絲粒特異組蛋白CENH3結(jié)合，可作為細(xì)胞學(xué)功能著絲粒檢測標(biāo)記。
[0011]本發(fā)明的木瓜CENH3蛋白對(duì)應(yīng)基因的核苷酸序列是利用序列比對(duì)的方法得到的。根據(jù)CENH3蛋白與H3蛋白的氨基酸序列之間的同源以及差異關(guān)系，我們以H3蛋白的氨基酸序列作為查詢序列，使用BLAST程序在EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，獲得與H3蛋白在C端相似但在N端具有差異的氨基酸作為木瓜CENH3蛋白的候選核苷酸序列以及氨基酸序列。確定抗體制備過程中所需要使用的多肽鏈，進(jìn)行抗體的制備。
[0012]使用CENH3蛋白特異的一段氨基酸序列人工合成多肽，將合成的多肽偶聯(lián)到蛋白載體上，然后常規(guī)免疫2只新西蘭大白兔，制備抗血清并進(jìn)行抗原親和純化，抗體經(jīng)過免疫熒光檢測，特異結(jié)合染色體著絲粒部位，證實(shí)該