一種甲型流感h3n2型熒光pcr診斷試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地說，涉及一種甲型流感H3N2型熒光 PCR診斷試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒為單股負(fù)鏈病毒，屬于正黏液病毒科，呈球形或絲狀，直徑病毒由三層構(gòu) 成，內(nèi)層為病毒核衣殼，含核蛋白和中層為病毒囊膜，由一層類脂體和一層膜蛋白（M)構(gòu) 成，Μ蛋白抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性，外層為兩種不同糖蛋白構(gòu)成的輻射狀突起，即血凝 素（ΗΑ)和神經(jīng)氨酸酶（ΝΑ)。根據(jù)和抗原的不同，又可分為許多亞型，Η可分為16個亞型， Ν有個9亞型（Ν1~Ν9)。其中Η1Ν1、Η2Ν2、Η3Ν2和2009年流行的Η1Ν1新甲型主要感染 人類，其它亞型的自然宿主主要是多種禽類和動物。其中對禽類危害最大的為Η5、Η7和Η9 亞型毒株，并且一旦感染人類也是屬于高致病性的，一旦發(fā)生變異而具有人與人的傳播能 力，也會導(dǎo)致人間禽流感的流行。流感病毒的抗原性變異主要是指ΗΑ和ΝΑ抗原結(jié)構(gòu)的改 變，在亞型內(nèi)部經(jīng)常發(fā)生小變異，即抗原漂移幾年可發(fā)生一次大的抗原變異，出現(xiàn)新的亞型 即抗原轉(zhuǎn)換當(dāng)ΗΑ和ΝΑ都發(fā)生了大的變異，并由此產(chǎn)生新的亞型可引起世界性大流行。
[0003] 在二十世紀(jì)就有三次大流行，一是1918年西班牙流感，由Η1Ν1亞型流感病毒所引 起，這次流感造成全世界2000-4000萬人死亡，成為人類傳染病歷史上最大的災(zāi)難。二是 1957年亞洲型流感，它由Η2Ν2亞型流感病毒所引起，是人與禽流感病毒基因重組的結(jié)果。 三是1968年香港型流感，由Η3Ν2亞型流感病毒引起，為人與禽流感病毒的重組。從近年全 球及國內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查分析可以看出，Η3Ν2亞型在大多數(shù)國家是流感流行的優(yōu)勢毒株， 我國也以甲型Η3Ν2和乙型為優(yōu)勢株。僅1968-1992年間我國發(fā)生的10次流感小流行中就 有7次都是由Η3Ν2亞型流感病毒所引起，并且在1998年和2002年我國也都發(fā)生了較大范 圍的亞型流感流行，其中北京市1998年11-12月的人群總發(fā)病率高達(dá)10%，總發(fā)病人數(shù)達(dá) 到了 100萬以上。2005年廣東省流感未發(fā)生大的流行，但局部暴發(fā)疫情仍比較活躍，并且主 要分布在中小學(xué)校，以Α(Η3Ν2)亞型流感病毒為優(yōu)勢株暴發(fā)疫情。在我國2011-2012年流 感監(jiān)測中，亞型流感病毒2012年在南方省份引起了小規(guī)模的暴發(fā)。我國的人口基數(shù)大，也 是流感高發(fā)地區(qū)，并且流感的新變種多次均首發(fā)于華南地區(qū)，屬于流感發(fā)病多發(fā)中心。廣東 省流感病原學(xué)監(jiān)測的結(jié)果分析可發(fā)現(xiàn)近年的優(yōu)勢株均有Η3Ν2亞型。
[0004] 近年來，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測上的優(yōu)勢，標(biāo)準(zhǔn)PCR過程分 為三步：DNA變性（90°C-96°C):雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA;退火 (60°C_65°C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈；延伸（70°C_75°C):在 Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，以脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)為原料，從引物 的Y端開始以從Y-3'端的方向延伸，最終合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過 變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。熒光定量PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光 譜技術(shù)而發(fā)展起來的一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測技術(shù)。
[0005]目前，類似的甲型流感試劑盒采用的方法主要為熒光PCR法、酶聯(lián)免疫法以及膠 體金法。酶聯(lián)免疫法與膠體金法都存在較長時間的"窗口期"，并且操作步驟較多，對實(shí)驗(yàn)人 員的要求高，易出現(xiàn)交叉污染，會因?yàn)檫@些偶然因素出現(xiàn)一定的假陽性率。
[0006] 熒光PCR較酶聯(lián)免疫法以及膠體金法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)高特異性，根據(jù)靶標(biāo)基因 保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物探針，能夠保證PCR反應(yīng)的高度特異性，避免交叉反應(yīng)。2)能對病毒進(jìn) 行定量檢測，可反映出患者體內(nèi)病原體拷貝數(shù)的高低和復(fù)制情況。定量檢測有助于判斷病 原體感染與疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，探討藥物對病原體的作用，了解感染性疾病病人用藥 后病情的變化情況。這對理解發(fā)病機(jī)制和預(yù)測抗病毒治療的有效性十分關(guān)鍵。3)操作簡 單，更適用于大規(guī)模的篩查。4)將PCR敏感性與探針特異性相結(jié)合，在很大程度上改變了傳 統(tǒng)PCR的缺陷，縮短了反應(yīng)時間，簡化了操作步驟。5)實(shí)時檢測技術(shù)可連續(xù)不斷的檢測PCR 過程中榮耀信號的變化，避免了傳統(tǒng)PCR的"平臺期效應(yīng)"，并且模板的定量不通過終產(chǎn)物， 而由Ct值算出，準(zhǔn)確性和靈敏性都有提高。6)在方法學(xué)上，熒光PCR法更加簡便，易操作， 基本沒有"窗口期"。7)由于熒光PCR是將模板信號以幾何方式放大的一個過程，其靈敏度 與定量準(zhǔn)確性有著非常明顯的優(yōu)勢，其靈敏度往往比上述的兩種方法高一個數(shù)量級。
[0007] 磁珠法是進(jìn)年發(fā)展迅速且被廣泛應(yīng)用的一種核酸提取方法，其優(yōu)于傳統(tǒng)方法的特 點(diǎn)可以總結(jié)為以下幾點(diǎn)：提取體積可變性大、吸附核酸專一性強(qiáng)、純度高、可實(shí)現(xiàn)自動化操 作。
[0008] 目前，國內(nèi)少有基于實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測甲型流感病毒的試劑盒應(yīng)用 于臨床檢測中，這些試劑盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。該類 試劑盒存在很多不足之處：1)檢測靈敏度低，約在l〇〇〇〇IU/ml左右；檢測范圍窄，一般在 1. 00E+04IU/ml~1. 00E+07IU/ml之間，對于臨床高值（大于5. 00E+07IU/ml)和低值（小于 1.00E+04IU/ml)的樣本無法檢測；2)酚-氯仿法是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣， 對于設(shè)備和人員操作要求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱 提取方法無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時長，特異性較差；3)無法有效去除樣 本中的PCR抑制物（如：黏液等）；4)國外試劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒及其使用方法，以 解決現(xiàn)有檢測方法靈敏度低、特異性差的問題。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供一種甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，所述甲型流感H3N2型熒 光PCR診斷試劑盒包括RNA提取溶液和PCR反應(yīng)液，其中，所述RNA提取溶液包括：RNA提 取溶液I:由質(zhì)量/體積比為〇. 2 %~1. 0 %的十二烷基硫酸鈉、體積/體積比為1. 0 %~ 4. 0%的曲拉通，0. 2mol/L~1.Omol/L的異硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠組成；RNA 提取溶液II:1〇〇~300mmol/L的4-輕乙基哌嘆乙橫酸和100~300mmol/L、ρΗ6· 5±0· 2 的氯化鈉；RNA提取溶液III:體積/體積比為0. 1%~1. 0%的曲拉通和100~300mmol/L 的氯化鈉；RNA提取溶液IV:礦物油；所述PCR反應(yīng)液包括：用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引 物和下游引物以及用于靶多核苷酸檢測的探針。
[0012] 優(yōu)選的，所述用于靶多核苷酸檢測的探針序列分別為：Η基因探針：5' -FAM-CTATC TACAAGGCTCCCATTGTAAATGAAGCT-BHQ1-3'；Ν基因探針：5'-FAM-CTCATAGCGTCTTGCATGCCTTTA GC-BHQ1-3'。
[0013] 優(yōu)選的，所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物和下游引物序列分別為：H基因上 游引物：5' -GGCTGCATGTTTGTATAACGG-3'；H基因下游引物：5' -CGCATTCTGACTCCTGGGT-3' ； N基因上游引物：5'-GTTGTCTTATAGCATTGGTGCC-3'；N基因下游引物： 5'-TCGGTTAAAGCCAATTGAGC-3' 。
[0014] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)序列為： 5'-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTTAGGGAAGCAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGGAAGTCTCATGGATG GACAAAGGGCGAACTTACA-3, 。
[0015] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括用于內(nèi)標(biāo)核苷酸擴(kuò)增的 上游引物和下游引物以及用于內(nèi)標(biāo)核苷酸檢測的探針，且所述用于內(nèi)標(biāo)核苷酸檢測的探針 序列為：5' -CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3'。
[0016] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括RT-PCR增強(qiáng)劑，所述 RT-PCR增強(qiáng)劑為濃度為100~500mmol/L的Mn(0Ac)2。
[0017] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括RNA洗脫液，所述RNA 洗脫液包括 0. 8 ~1. 2mol/L的Tris-HCl和 0. 1 ~1.Omol/L的EDTA。
[0018] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0019] 優(yōu)選的，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括酶混合液，所述酶混合 液中包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0020] 本發(fā)明還提供一種權(quán)利要求6-9中任意一項(xiàng)所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷 試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用步驟包括：S01 :取1200 μ 1~lml/人份的RNA提 取溶液I和1 μ 1/人份的內(nèi)標(biāo)，混和均勻并形成RNA提取試劑I-mix，瞬時離心后備用；S02 : 根據(jù)待測樣本、陰性對照和陽性對照的數(shù)量，按39 μ 1/人份的PCR反應(yīng)液和1 μ 1/人份的 Μη2+溶液的比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及酶混合液，充分混勻成PCR-mix，瞬時離心后備用； S03 :每管加入200 μ 1~lml RNA提取溶液1-mix，然后加入100 μ 1~lml待測樣本，蓋上 管蓋，震蕩混勻10秒鐘，瞬時離心；S04 :每管加入50 μ 1~400 μ 1 RNA提取溶液II，震蕩 混勻10秒鐘后，室溫靜置10~30分鐘；S05 :靜置結(jié)束后瞬時離心，將離心管置于磁珠分 離器上，2~5分鐘后緩慢將溶液吸出；S06 :每管加入400 μ 1~lml RNA提取溶液III和 100 μ