于37°C孵育lh，按照步驟一洗 板，拍干；
[0115] 步驟四：酶標(biāo)二抗孵育：加入工作濃度的HRP標(biāo)記的兔或羊抗鴨IgG稀釋液，酶標(biāo) 二抗稀釋度為1:1600,37°C孵育0. 5h，按照步驟一洗板，拍干。
[0116] 步驟五：顯色：加入TMB顯色液100μL/孔，避光顯色30min;
[0117] 步驟六：終止：加入終止液2mol/LH2S04, 50μL/孔；
[0118] 步驟七：讀數(shù)：用酶標(biāo)儀以雙波長形式讀取0D45Qnni-0D63Qnni值。
[0119] 實施例4基于VP4重組蛋白的ELISA方法的建立和應(yīng)用
[0120] 1、抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定：
[0121] 采用方正滴定，將純化的VP4重組蛋白用包被液（pH9. 6)稀釋并加入酶標(biāo)板中，按 每個稀釋度兩個重復(fù)，將DHAV-1陰陽性血清分別稀釋后加入到重組VP4包被的酶標(biāo)板中， 將酶標(biāo)二抗HRP-兔抗鴨IgG先以1:2000倍稀釋，參照實施例3進(jìn)行間接ELISA檢測，最終 以P/N值最大的稀釋度確定最佳包被抗原稀釋度和最佳血清稀釋度。
[0122] 用核酸蛋白儀測得純化的VP4重組蛋白初始濃度為1. 351mg/ml，每個抗原稀釋度 設(shè)置2個重復(fù)，取平均值。結(jié)果如表4所示，選擇P/N值最大者為最佳條件，即VP4重組蛋 白的最佳包被濃度為1:400稀釋（3. 375μg/ml)、血清1:160稀釋。
[0123] 2、酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
[0124] 將純化的重組VP4重組蛋白用最佳的抗原稀釋度來包被酶標(biāo)板，將DHAV-1陰陽性 血清按最佳稀釋度稀釋，將酶標(biāo)二抗HRP-兔抗鴨IgG稀釋為不同濃度，參照實施例3進(jìn)行 間接ELISA檢測，以P/N值最大的稀釋倍數(shù)為酶標(biāo)二抗最佳的工作濃度。
[0125] 如表5所示，每個濃度三個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者為最佳二抗稀釋度， 即基于VP4重組蛋白的ELISA最佳酶標(biāo)二抗稀釋度為1:1600，
[0126] 表4VP4重組蛋白抗原包被濃度和血清稀釋度選擇
[0129] 表5包被重組蛋白VP4酶標(biāo)二抗工作濃度優(yōu)化
[0130]
[0131] 3、最佳包被條件：
[0132] 按上述VP4重組蛋白最佳抗原稀釋度包被酶標(biāo)板，37°Clh4°C過夜、37°C3h4°C 過、4°C過夜這三種包被條件設(shè)置陰、陽性血清對照，各6個重復(fù)，酶標(biāo)二抗最佳的稀釋倍數(shù) 稀釋二抗，參照實施例3操作進(jìn)行間接ELISA檢測序，以P/N值最大時，確定最佳包被條件。
[0133] 如表6所示，每種包被條件6個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者作為最佳包被 條件，即基于VP4重組蛋白的ELISA最佳包被條件為37°C孵育3h后4°C過夜。
[0134] 表6VP4重組蛋白包被條件優(yōu)化
[0135]
[0136] 4、最佳封閉液選擇：
[0137] 用以上摸索的最佳抗原稀釋倍數(shù)、最佳包被條件，將VP4重組蛋白分別包被酶標(biāo) 板，用以下八種封閉液來封閉：5%胎牛血清、10%胎牛血清、1%明膠、5%明膠、1%脫脂奶 粉、5 %脫脂奶粉、1 %BSA和％BSA，每個孔做3個重復(fù)，以最佳的抗體稀釋倍數(shù)稀釋血清及 酶標(biāo)二抗，最后在酶標(biāo)儀上測定〇D4Mnni-〇D63(]nni值。以P/N值最大的封閉液為最佳封閉液。
[0138] 如表7所示，八種封閉液各3個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者作為最佳封閉 液，即基于VP4重組蛋白的ELISA最佳封閉液為1 %脫脂奶粉。
[0139] 表7包被重組蛋白VP4最佳封閉液選擇
[0140]

[0142] 5、封閉時間確定：
[0143] 按照選出的最佳封閉液條件，設(shè)置30min、60min、90min和120min四個封閉時間梯 度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行最佳封閉時間摸索。
[0144] 如表8所不，每一個封閉時間3個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者作為最佳封 閉時間，即基于VP4重組蛋白的ELISA的最佳封閉時間均為37°Clh。
[0145] 表8包被重組蛋白VP4封閉時間選擇
[0146]
[0147] 6、血清及酶標(biāo)二抗孵育時間確定：
[0148] 按以上摸索好的包被條件、封閉條件、酶標(biāo)二抗最佳稀釋度進(jìn)行操作，設(shè)置30min、 60min、90min和120min四個孵育時間梯度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行最佳陰、陽性血清及 酶標(biāo)二抗孵育時間摸索。
[0149] 如表9和表10所示，每個時間點3個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者，即基于 VP4重組蛋白的ELISA的最佳血清孵育時間為lh，最佳二抗孵育時間為0. 5h。
[0150] 表9包被重組蛋白VP4血清孵育時間優(yōu)化
[0152] 表10包被重組蛋白VP4酶標(biāo)二抗孵育時間優(yōu)化
[0153]
[0154] 7、顯色時間確定：
[0155] 設(shè) 5min、lOmin、15min、20min、25min和 30min六個時間梯度，均于 37°C避光加入 底物顯色液，每個顯色時間陰、陽性血清各設(shè)置6個重復(fù)，取平均值，最后測定0D45(]nni-0D63Qnni 值，以陽性值彡1. 0且P/N值最大的底物作用時間為最佳顯色時間。
[0156] 如表11所示，每個時間點3個重復(fù)，取平均值，選擇P/N值最大者，即基于VP4重 組蛋白的ELISA的最佳顯色時間為30min。
[0157] 表11包被重組蛋白VP4最佳顯色時間選擇
[0158]
[0159] 8、陰陽性臨界值的確定：
[0160] 分別以上述優(yōu)化的VP4重組蛋白的最佳條件檢測60份陰性血清0D45(]nni-0D63(]nni值， 計算cut-off值=均值+3X方差，S卩為陽性閾值。
[0161] 如表12所示，測定60份陰性血清0D45Qnni-0D63Qnni值，陽性閾值=平均值+3XSD作 為陽性閾值，得到VP4陽性閾值為0. 078+3X0. 041 = 0. 203。
[0162] 表12包被重組蛋白VP460份陰性血清0D45Qnni-0D63Qniit
[0163]
[0164] 9、重復(fù)1生試驗：
[0165] 分別用相同批次和不同批次的VP4純化重組蛋白包被的酶標(biāo)板檢測6份血清的 〇D45(]n"r〇D63(]nni值，每份血清設(shè)置6個重復(fù)，檢測其板內(nèi)、板間變異系數(shù)，分析建立的ELISA方 法的重復(fù)性。
[0166] (1)板內(nèi)重復(fù)性試驗
[0167] VP4重組蛋白變異系數(shù)在1.58%~4. 76%之間，小于10%，如表13所示，說明建 立的ELISA方法具有較好的板內(nèi)重復(fù)性。
[0168] 表13包被重組蛋白VP4板內(nèi)變異系數(shù)測定
[0171] (2)板間重復(fù)性試驗
[0172] VP4變異系數(shù)0. 10%~9. 25%之間，小于10%，見表14所示，說明建立的ELISA 方法具有較好板間的重復(fù)性。
[0173] 表14包被重組蛋白VP4板間變異系數(shù)測定
[0174]
[0175] 10、特異性試驗：
[0176] (1)特異性交叉試驗
[0177] 用建立的ELISA方法檢測鴨沙門氏菌、鴨大腸桿菌、鴨腫頭敗血癥病毒、禽流感病 毒（H5)、鴨瘟病毒和鴨里默氏桿菌的陽性血清，設(shè)置DHAV-1陽性血清、陰性血清對照，如表 15所示，每個血清設(shè)置3個重復(fù)取平均值，六種其他病原陽性血清0D45(]nni-0D63(]nni值均小于陽 性閾值0. 203且陽性血清與陰性血清的比值均小于2. 1，表明建立的ELISA方法特異性很 好。
[0178] 表15VP4重組蛋白ELISA方法特異性檢測
[0179]
[0180] (2)特異性阻斷試驗
[0181] 按抗原10:1陰或陽性血清的體積比于37°C中和lh后，分別用建立的ELISA方法 檢測中和前后的血清，每種血清6個重復(fù)，計算阻斷率。如表16所示，將DHAV-1陽性、陰性 血清與VP4重組蛋白反應(yīng)，將阻斷前后的血清進(jìn)行檢測，分別設(shè)置6個重復(fù)，取平均值。得到 VP4陽性血清阻斷率為85. 2%，陰性血清阻斷率為6. 4%。表明VP4重組蛋白能與DHAV-1 陽性血清特異性中和。
[0182] 表16VP4重組蛋白阻斷試驗
[0183]
[0184] 11、ELISA方法敏感性檢測：
[0185] 取8份已知的DHAV-1陽性血清，以2倍倍比稀釋，用于建立的ELISA方法檢測，能 檢測出陽性的最大血清稀釋度為靈敏度。
[0186] 如表17所示，取8份鴨甲肝病毒陽性血清，從1:100開始進(jìn)行2倍比稀釋，以能檢 測出陽性最大的稀釋倍數(shù)作為靈敏度。以表17的數(shù)據(jù)得出建立的VP4重組蛋白ELISA方 法靈敏度為1:1600。
[0187] 表17VP4重組蛋白ELISA方法靈敏度檢測
[0188]
[0189] 12、基于VP4重組蛋白ELISA檢測方法的應(yīng)用及與基于DHAV-1的ELISA方法符合 率比較：
[0190] 基于DHAV-1的ELISA方法：以8μg/mL的DHAV-1于37°C3h后4°C過夜包被，接 入1:160稀釋的被檢血清孵育lh，以5%明膠37°C封閉0. 5h，加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記 的兔抗鴨IgG孵育40min，陰陽