一株二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安 全免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 6-二叔下基對(duì)甲酪（BHT)，是一種油溶性的有機(jī)化合物。它主要在食品添加劑 中被用作為抗氧化劑（E編碼為E321)，也在化妝品、藥物、飛機(jī)燃料、橡膠、石油制品和標(biāo)本 中有抗氧化作用。雖毒性較大，但其抗氧化能力較強(qiáng)，耐熱及穩(wěn)定性好，既沒(méi)有特異臭，也 沒(méi)有遇金屬離子呈色反應(yīng)等缺點(diǎn)，而且價(jià)格低廉，僅為抗氧化劑下基徑基茵香酸（BHA)的 1/5~1/8,我國(guó)仍作為主要抗氧化劑使用。一般與BHA配合使用，并W巧樣酸或其他有機(jī) 酸為增效劑。我國(guó)規(guī)定可用于食用油脂、油炸食品、餅干、方便面、速煮米、果仁罐頭、干魚(yú)制 品和騰臘肉制品，最大使用量0. 2g/kg。
[0003] 目前檢測(cè)二叔下基對(duì)甲酪的方法主要有氣相色譜法（GC)、液相色譜法（HPLC)、分 光光度法、電化學(xué)測(cè)定法、氣質(zhì)聯(lián)用法等方法，但是運(yùn)些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較 貴等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，因此建立一種快速簡(jiǎn)便的二叔下基對(duì)甲酪檢測(cè) 方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí) 對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高特異 性和高靈敏度的單克隆單體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株對(duì)二叔下基對(duì)甲酪具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度的單 克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，提供一株二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì) 胞株制備的抗體對(duì)二叔下基對(duì)甲酪具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可W用來(lái)建立二叔下基 對(duì)甲酪的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0006] 一株二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為2B2,已保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，分類(lèi)命名為單克隆細(xì)胞株，保藏日期為2015年5 月19日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10870。
[0007] 二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體，由所述保藏號(hào)為CGMCCNo. 10870的二叔下基對(duì)甲 酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生。 陽(yáng)00引本發(fā)明提供的2B2細(xì)胞株的制備基本步驟為： (1)完全抗原的合成：稱(chēng)取BHT類(lèi)似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA)24. 8mg，碳 二亞胺（EDC) 38. 3mg，徑基班巧酷亞胺（畑S) 23.Omg，用1血無(wú)水DMF溶解(稱(chēng)為A液)， 室溫?cái)埌璺磻?yīng)地。稱(chēng)取牛血清白蛋白（BSA) 56mg溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中 (稱(chēng)為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，得到偶聯(lián)物BHTA-BSA 混合液即為完全抗原，通過(guò)透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收 掃描方法鑒定； (2) 小鼠的免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。二叔下基對(duì)甲酪完 全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次 免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之 間間隔21天。最后一次用二叔下基對(duì)甲酪完全抗原(不含佐劑)沖擊免疫；通過(guò)間接化ISA 檢測(cè)血清效價(jià)和抑制； (3) 細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過(guò)聚乙二醇（PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤 細(xì)胞融合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接化ISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行= 次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2B2 ; (4) 雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過(guò)化ISA法測(cè)定靈敏度和特異性。
[0009] 所述二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全中對(duì)二叔下基對(duì)甲酪的殘 留檢測(cè)。 陽(yáng)010] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的抗二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)二叔 下基對(duì)甲酪有較好的檢測(cè)靈敏度和特異性（ICw值為8. 9yg/L)。
[0011] 生物材料樣品保藏：一株二叔下基對(duì)甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為 2B2,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：北京 市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，分類(lèi)命名為單克隆細(xì)胞株，保藏 日期為2015年5月19日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10870。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1 2B2單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014] 本發(fā)明通過(guò)將二叔下基對(duì)甲酪完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng) 基培養(yǎng)，通過(guò)間接化ISA和間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)二叔下基對(duì)甲酪有 較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0015] 實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株2B2的制備 (1)完全抗原的合成：稱(chēng)取BHT類(lèi)似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA) 24. 8mg，EDC38. 3mg，N服23.Omg，用1血無(wú)水DMF溶解(稱(chēng)為A液)，室溫?cái)埌璺磻?yīng)地。稱(chēng)取BSA56mg 溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中（稱(chēng)為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中， 室溫反應(yīng)過(guò)夜，得到偶聯(lián)物BHTA-BSA混合液即為完全抗原，通過(guò)透析分離完全抗原和未偶 聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定。
[0016] (2)動(dòng)物免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取二叔下基對(duì)甲 酪完全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng) 免之間間隔21天。S免后7天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制， 選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0017] (3)細(xì)胞融合：在沖擊免疫S天后，按照常規(guī)陽(yáng)G(聚乙二醇，分子量為4000)方法 進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下： a、 無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； b、 收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； C、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照1 : 5的計(jì)數(shù)比例混合，離屯、后用50%PEG融合，時(shí)間1min,之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離屯、后懸浮于含20%胎牛血清、2%的 50XHAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5% (?的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。
[0018] (4)細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩 選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的IOOXHT的RPMI-1640過(guò)渡培養(yǎng)液 進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接化ISA篩選出陽(yáng) 性細(xì)胞孔，第二步選用二叔下基對(duì)甲酪為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制 效果測(cè)定。選擇對(duì)二叔下基對(duì)甲酪標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞 克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)=次，獲得細(xì)胞株2B2。
[0019] (5)單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟 油ImL;7天后每只小鼠腹腔注射1XIO6雜交瘤細(xì)胞，從第屯天開(kāi)始收集腹水，將腹水通過(guò) 辛酸-硫酸錠法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0020] 使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定單克隆抗體二叔下基對(duì)甲酪的ICso為：8. 9yg/L，說(shuō)明 對(duì)二叔下基對(duì)甲酪有很好的靈敏度，可用于二叔下基對(duì)甲酪免疫分析檢測(cè)。 陽(yáng)02U 實(shí)施例2抗體應(yīng)用 將雜交瘤細(xì)胞株2B2通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于二叔下基對(duì)甲酪的快速 檢測(cè)，具體步驟如下： 曰、包被：將包被原BHTA-OVA用0. 05MpH9.6碳酸鹽緩沖液從2嗦/mL開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)?10〇4 17孔，37°(：反應(yīng)化； b、洗涂：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗涂液洗涂3次，每次3min; C、封閉：拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C反應(yīng)化，洗涂后烘干備用；t加樣：將抗血清從1:1000開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)⒓尤氲礁飨♂尪鹊陌豢字?，IOOyL/ 孔，37°C反應(yīng)Ih;充分洗涂后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG, 100yL/孔，37°C反應(yīng) 比； e、 顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗涂后，每孔加入IOOiiL的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng) ISmin; f、 終止和測(cè)定：每孔加入50M1 2MH2SO4終止液W終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔 的〇〇4日。值； 邑、結(jié)果判讀：W〇〇45。值大于或等于陰性對(duì)照孔的2. 1倍（即P/N> 2. 1)所對(duì)應(yīng)的血清 最高稀釋倍數(shù)即為血清的化ISA效價(jià)； 11、標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置0、1、2、5、10、20、50和100^旨/16冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用間接競(jìng)爭(zhēng)化15八 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其ICs。為8. 9yg/L。 陽(yáng)0巧溶液的配置： 碳酸鹽緩沖液（CBS):稱(chēng)取NazCOs1.59g，NaHC〇3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合， 加雙蒸水至約SOOmL混勻，調(diào)pH值至9. 6,加雙蒸水定容至1000 mL, 4°C膽存?zhèn)溆茫?憐酸鹽緩沖液（PBS):8.00g化Cl，0.2gKCl，0.2gKH2P04,2.9gNa2HP04?12H20， 溶于800血純水中，用化OH或肥1調(diào)抑到7. 2~7. 4,定容至1000血； PBST:含 0. 05% 吐溫 20 的PBS; TMB顯色液：A液：胞2冊(cè)〇4 ? 12&0 18. 43g，巧樣酸9. 33g，純水定容至1000血；B液： 60mgTMB溶于100血乙二醇中；A、B液按體積比1:5混合即為T(mén)MB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0023] 2B2單克隆抗體的交叉反應(yīng)率如表1所示。
[0024] 表1. 2B2單克隆抗體的交叉反應(yīng)率
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本 發(fā)明申請(qǐng)范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為2B2,已保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10870。2. 二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體，其特征在于：由所述保藏號(hào)為CGMCCNo. 10870的二 叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生。3. 權(quán)利要求2所述的二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于：用于食品安全 中對(duì)二叔丁基對(duì)甲酚的殘留檢測(cè)。
【專(zhuān)利摘要】一株二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明的二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC？No.10870。二叔丁基對(duì)甲酚單克隆抗體，由所述保藏編號(hào)為CGMCC？No.10870的雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生，此細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，對(duì)二叔丁基對(duì)甲酚具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度IC50值為8.9μg/L，可以用于食品安全中二叔丁基對(duì)甲酚的殘留檢測(cè)。CGMCC No.1087020150919
【IPC分類(lèi)】C07K16/44, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/577
【公開(kāi)號(hào)】CN105296436
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510798015
【發(fā)明人】劉麗強(qiáng), 孫成, 胥傳來(lái), 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月19日