。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下實(shí)施例所采用的原料來源說明:京尼平(geninpin)購自成都普菲惠生物技術(shù)有限公司；新鮮的雞蛋從超市購買；無菌超純水由超純水自制系統(tǒng)自制；所用到的6孔板購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；SK0V3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞研究中心。
[0032]以下實(shí)施例在取溶液及蛋清等液體時(shí)，采用“毫升”為單位，即ml。溶質(zhì)的質(zhì)量為“克”，即g。本發(fā)明中的京尼平的濃度均為質(zhì)量百分比(％)。
[0033]一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0034](1)將京尼平(geninpin)加入到超純水溶劑中，分別配制成質(zhì)量百分比濃度為10%,5%,1%,0.5%,0.25%,0.125% 6個(gè)濃度梯度。較高濃度的京尼平(大于4% )，可以先將溶液預(yù)熱到50°C左右，再將京尼平加入，快速攪拌后溶解。攪拌后，超聲振蕩10-30min，放入37°C充分溶解，再各取0.2mL分別加入各孔均含有2mL新鮮雞蛋清的6孔板中，攪拌混勻；
[0035]制備時(shí)可以選其它容器(如燒杯、培養(yǎng)皿等)，不局限于6孔板。制備完成后，可添加到相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板、瓶、皿等(即制備的時(shí)候其實(shí)反應(yīng)容器可以隨意選擇，但是到細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候才需要轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板或瓶皿中)。京尼平的濃度以1%，0.5%，0.25%,
0.125%為最適宜范圍，不設(shè)0濃度；在各濃度設(shè)定的基礎(chǔ)上，加入京尼平溶液和蛋清體積比為0.2:2 S卩1:10，也可以進(jìn)一步降低此比例，但不宜增大；
[0036](2)將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入37°C恒溫箱24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0037]京尼平在水中溶解度不大，常溫25°C下溶解度約為1%左右，隨著溫度的升高，溶解度增大。但京尼平在高溫下穩(wěn)定性不太好，因此建議在37°C左右的水中溶解京尼平，此時(shí)其溶解度為2%左右。
[0038](3)將步驟(2)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)三次；去除多余京尼平分子，防止培養(yǎng)過程中對細(xì)胞的損傷。
[0039](4)反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)，加入事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，即可獲得用于比較多個(gè)硬度梯度蛋清培養(yǎng)支架材料的細(xì)胞培養(yǎng)。
[0040]在培養(yǎng)過程中，短期培養(yǎng)，如7天左右，可連續(xù)追加培養(yǎng)液培養(yǎng)；長期培養(yǎng)，如15天以上，每3天各孔更新一半培養(yǎng)液的辦法進(jìn)行換液。
[0041](5)根據(jù)所述的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，可靈活使用。制備好的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料可進(jìn)一步制成凍干粉末，添加到正在貼壁對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶(皿)里，短期培養(yǎng)后，易于實(shí)現(xiàn)材料和細(xì)胞的分離，研究材料對細(xì)胞形態(tài)、生理、生化、行為的影響。
[0042]實(shí)施例1
[0043]一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0044]1)將0.0125g京尼平加入到9.9875mL超純水中，配制成0.125%濃度，攪拌，超聲振蕩10-30min，放入37°C充分溶解，再各取0.2mL分別加入各孔均含有2mL新鮮雞蛋清的6孔板中，攪拌混勻；
[0045]2)將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入37°C恒溫箱24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0046]3)將步驟(2)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)三次；
[0047]4)反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的無菌狀態(tài)，各加入事先準(zhǔn)備好的卵巢癌SK0V3細(xì)胞懸液lmL，即可獲得用于細(xì)胞培養(yǎng)的0.125%京尼平交聯(lián)的硬度蛋清培養(yǎng)支架材料。在培養(yǎng)3天后用光學(xué)倒置顯微鏡觀察拍照。如圖3a、圖4a所示。
[0048]支架材料凍干后形貌如圖2a。
[0049]實(shí)施例2
[0050]一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0051]1)將0.025g京尼平加入到9.975mL超純水中，配制成0.25%濃度，攪拌，超聲振蕩10-30min，放入37°C充分溶解，再各取0.2mL分別加入各孔均含有2mL新鮮雞蛋清的6孔板中，攪拌混勻；
[0052]2)將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入37°C恒溫箱24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0053]3)將步驟(2)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)三次；
[0054]4)反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證培養(yǎng)支架材料的無菌狀態(tài)，各加入事先準(zhǔn)備好的卵巢癌SK0V3細(xì)胞懸液lmL，即可獲得用于細(xì)胞培養(yǎng)的0.25%京尼平交聯(lián)硬度的蛋清培養(yǎng)支架材料。在培養(yǎng)3天后用光學(xué)倒置顯微鏡觀察拍照。如圖3b、圖4b所示。
[0055]支架材料凍干后形貌如圖2b。
[0056]實(shí)施例3
[0057]—種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0058]1)將0.05g京尼平加入到9.95mL超純水中，配制成0.5%濃度，攪拌，超聲振蕩10-30min，放入37°C恒溫箱充分溶解，再各取0.2mL分別加入各孔均含有2mL新鮮雞蛋清的6孔板中，攪拌混勻；
[0059]2)將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入37°C恒溫箱24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0060]3)將步驟(2)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)三次；
[0061]4)反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)，各加入事先準(zhǔn)備好的卵巢癌SK0V3細(xì)胞懸液lmL，即可獲得用于細(xì)胞培養(yǎng)的0.5%京尼平交聯(lián)的硬度蛋清培養(yǎng)支架材料。在培養(yǎng)3天后用光學(xué)倒置顯微鏡觀察拍照。如圖3c、圖4c所示。
[0062]支架材料凍干后形貌如圖2c。
[0063]實(shí)施例4
[0064]一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0065]1)將0.lg京尼平加入到9.9mL超純水中，配制成1%濃度，攪拌，超聲振蕩10-30min，放入37°C恒溫箱充分溶解，再各取0.2mL分別加入各孔均含有2mL新鮮雞蛋清的6孔板中，攪拌混勻；
[0066]2)將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入37°C恒溫箱24h，使其充分交聯(lián)完全；
[0067]3)將步驟(2)得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，靜止12h，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)三次；
[0068]4)反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射30min,保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)，各加入事先準(zhǔn)備好的卵巢癌SK0V3細(xì)胞懸液lmL，即可獲得用于細(xì)胞培支架材料的1%京尼平交聯(lián)的硬度蛋清培養(yǎng)支架材料。在培養(yǎng)3天后用光學(xué)倒置顯微鏡觀察拍照。如圖3d、圖4d所示。
[0069]支架材料凍干后形貌如圖圖2d。
[0070]實(shí)施例5
[0071]一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0072]1)將0.5g京尼平加入到9