一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備技術(shù)，特別涉及一種用京尼平(genipin)交聯(lián)劑交聯(lián)法制備得到的多個硬度梯度新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程支架材料一般分為天然材料和人工合成材料。純?nèi)斯ず铣刹牧先菀渍T發(fā)炎癥，韌性也難以保證。天然材料如膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸等易于降解，且有一定的生物功能。根據(jù)不同的研究目的，可以將天然材料進(jìn)行必要的化學(xué)修飾，改變優(yōu)化其材料形貌和力學(xué)性質(zhì)，用于組織工程需要。
[0003]蛋白質(zhì)作為天然高分子，具有良好的生物降解性和生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)及組織工程中有更廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]蛋清培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長發(fā)育所需要的全部營養(yǎng)和信號成分，蛋清是一種以水作為介質(zhì)，以蛋白作為分散相的膠體物質(zhì)，約占雞蛋總重的60%?63%。其中的85%?89%為水分，而剩余的固形物中，約有80%的蛋白質(zhì)，20%的碳水化合物、脂質(zhì)、無機(jī)成分和維生素等，其理化成分和力學(xué)性能及形貌有較大范圍的可調(diào)節(jié)性，特別經(jīng)濟(jì)，易于獲取。
[0005]蛋白質(zhì)具有大量的親水基團(tuán)，能在加熱或溶劑的作用下發(fā)生凝膠化作用，形成具有三維結(jié)構(gòu)的凝膠；同時其側(cè)鏈含有大量的活性基團(tuán)，包括氨基、羥基、巰基、酚基和羧基，可以被化學(xué)改性與交聯(lián)，制備新結(jié)構(gòu)的高分子材料。機(jī)體細(xì)胞外基質(zhì)的材料形貌和力學(xué)性質(zhì)在不同個體及同一個體的不同發(fā)育階段有很大的差異，比如衰老、癌變等。這里通過對蛋清培養(yǎng)支架材料采用不同方式改性，制備不同硬度和形貌的材料用于研究細(xì)胞培養(yǎng)及對細(xì)胞增殖分化、蛋白表達(dá)、侵襲轉(zhuǎn)移等行為的影響規(guī)律。
[0006]蛋白質(zhì)化學(xué)交聯(lián)是一類重要化學(xué)修飾反應(yīng)，所用交聯(lián)劑為含有雙功能基團(tuán)的化學(xué)試劑。京尼平分子內(nèi)隱含一個戊二醛的結(jié)構(gòu)，能與氨基自發(fā)反應(yīng)，生成物有熒光效應(yīng)，便于實(shí)驗(yàn)觀察。產(chǎn)物是深藍(lán)綠色的。此外京尼平是從天然產(chǎn)物提取出來的，比戊二醛毒性小5000-10000倍。京尼平在水中溶解度不大，常溫(25°C )下溶解度約為1%左右，隨著溫度的升高，溶解度增大。但京尼平在高溫下穩(wěn)定性不太好，因此建議在37°C左右的水中溶解京尼平，此時其溶解度為2%左右。如果要配制較高濃度的京尼平(大于4% )，可以先將溶液預(yù)熱到50°C左右，再將京尼平加入，快速攪拌后溶解，這樣可以縮短京尼平在高溫下的時間。當(dāng)然，如果可以的話加入少量乙醇或丙酮，可以顯著提高京尼平在水中的溶解度。
[0007]京尼平(genipin)用于蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的交聯(lián)改性，極其方便，且安全無毒副作用，所以是目前研究的熱點(diǎn)，常用于生物醫(yī)學(xué)高分子材料的交聯(lián)改性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于為了提供一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法及應(yīng)用，工藝簡單，周期短，且適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，交聯(lián)度均勻，表面多皺褶或多孔，形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一。
[0010]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:一種新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的，包括以下步驟:
[0011 ] 第一步，將京尼平加入到無菌超純水中，攪拌，超聲振蕩充分，放入25?40°C充分溶解，將0.2mL京尼平溶液加入含有2mL新鮮雞蛋清的反應(yīng)容器中，攪拌混勻；
[0012]第二步，將加入交聯(lián)劑京尼平的雞蛋清放入恒溫箱充分交聯(lián)完全；
[0013]第三步，將第二步得到的改性蛋清培養(yǎng)支架材料用移液槍逐滴滴入PBS溶液，保證能浸過材料但不溢出，靜止12h以上，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重復(fù)若干次；
[0014]第四步，反應(yīng)后，得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料置于細(xì)胞超凈工作臺，紫外照射殺菌后，即獲得改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。
[0015]第一步中京尼平溶液的質(zhì)量百分比濃度小于等于10%。
[0016]第二步中交聯(lián)時間不低于24h，恒溫箱中溫度為25_40°C。
[0017]所述的紫外照射殺菌具體為超凈臺內(nèi)紫外光照20_30min。
[0018]第四步得到的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料進(jìn)一步制成改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料凍干粉末。
[0019]基于所述的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的細(xì)胞培養(yǎng)方法，將改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架移入六孔板中，向每孔加入0.4mL事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5X 104cells/mL,細(xì)胞數(shù)量每孔不低于104個；在培養(yǎng)過程中，小于等于7天的培養(yǎng)時間，采用連續(xù)追加培養(yǎng)液法進(jìn)行培養(yǎng)；大于等于15天以上的培養(yǎng)期，則采用每3天各孔更新一半培養(yǎng)液的辦法進(jìn)行換液。
[0020]所用的細(xì)胞懸液為正常動物及人體細(xì)胞或癌細(xì)胞中的貼壁細(xì)胞。
[0021]所述的基于所述的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的細(xì)胞培養(yǎng)方法，所述的每天追加培養(yǎng)液法中每天追加量為0.5mL。
[0022]所述的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法得到的凍干粉末的應(yīng)用，將所述的改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料凍干粉末添加到正在貼壁對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶或皿里，短期培養(yǎng)后用以實(shí)現(xiàn)材料和細(xì)胞的分離。
[0023]根據(jù)新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法得到的凍干粉末的應(yīng)用，每瓶T25卡氏瓶中添加的凍干粉末量小于等于0.05go
[0024]有益效果:
[0025]這種通過京尼平交聯(lián)劑交聯(lián)法制備得到的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，硬度梯度容易控制，所形成的皺褶和孔洞利于細(xì)胞的黏附生長。制備過程簡單，材料經(jīng)濟(jì)，易于實(shí)現(xiàn)，蛋清本身可以給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)支持，不涉及采用高溫高壓裝置，安全無毒副作用。
【附圖說明】
[0026]圖1是純蛋清隨時間變化及交聯(lián)蛋清隨京尼平溶液濃度變化的流變學(xué)剪切力特征。本發(fā)明新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的流變學(xué)剪切力的變化特征，說明交聯(lián)確實(shí)改變了培養(yǎng)支架材料蛋清的力學(xué)性質(zhì)。
[0027]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1、2、3、4、5、6獲得的新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的凍干掃描電鏡SEM圖像；各圖顯示了京尼平完全交聯(lián)后的蛋清支架材料的形貌變化。(a)0.125%京尼平處理；(b)0.25%京尼平處理；(c)0.5%京尼平處理；(d)l%京尼平處理；(e)5%京尼平處理；(f) 10%京尼平處理?？梢姡景l(fā)明制備得到新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料表面皺褶、多孔，形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一。
[0028]圖3是采用本發(fā)明制備得到新型改性蛋清細(xì)胞培養(yǎng)支架材料培養(yǎng)卵巢癌SK0V3細(xì)胞的光學(xué)電鏡結(jié)果，(a-f)卵巢癌SK0V3細(xì)胞在交聯(lián)改性蛋清培養(yǎng)支架材料中聚集生長的情況。(a)0.125%京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料；(b)0.25%京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料；(c) 0.5 %京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料；(d) 1 %京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料；(e) 5%京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料；(f) 10%京尼平處理的蛋清培養(yǎng)支架材料(圓圈表明細(xì)胞已充滿孔洞生長)。由圖可見該材料結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞黏附生長。
[0029]圖4細(xì)胞在培養(yǎng)支架材料中的生長位點(diǎn)(用染料hocheSt2344將各濃度
0.125%，ο.25% ,ο.5% , 1 %京尼平交聯(lián)蛋清中生長的卵巢癌SK0V3細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色)。
[0030]圖5不同濃度0.125%,0.25%,0.5%、1 %、5%的京尼品交聯(lián)蛋清培養(yǎng)支架材料凍干粉對卵巢癌SK0V3細(xì)胞形態(tài)生長的影響。可以看出隨交聯(lián)程度的增加，細(xì)胞的形態(tài)更加不規(guī)則，長寬比增大，偽足變長