一種新來源亞硝酸降解低分子肝素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新來源亞硝酸降解低分子肝素的制備方法，特別設(shè)及一種利用牛 來源（牛肺、牛腸）和羊來源（羊腸）肝素通過亞硝酸降解制備低分子肝素的方法，屬于原 料藥制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝素屬于一種抗凝血臨床藥物，可從各種哺乳動(dòng)物的粘膜組織提取，1916年首先 發(fā)現(xiàn)于狗的肝臟中，后來為得到高產(chǎn)量又將來源主要轉(zhuǎn)向牛和豬。但由于上世紀(jì)末歐洲爆 發(fā)的"瘋牛病"和"羊痊癢病"由牛與羊傳染給人類而致死，進(jìn)而牛和羊來源肝素被禁用，導(dǎo) 致目前肝素類藥物原料僅限于豬來源。低分子肝素主要經(jīng)肝素降解制備而成，具有比肝素 生物活性更高，半衰期更長(zhǎng)和副作用更少的臨床治療優(yōu)勢(shì)，屬于一種高效抗血栓藥物，而且 每年有超過60%的肝素用于制備低分子肝素。目前歐洲藥典收錄至少五種低分子肝素，但 運(yùn)些低分子肝素均限制為豬來源肝素為原料制備，運(yùn)樣形成了低分子肝素原料來源單一的 產(chǎn)業(yè)鏈。運(yùn)種原料來源單一的市場(chǎng)結(jié)構(gòu)已潛在地威脅肝素類藥物市場(chǎng)的穩(wěn)定。目前"瘋牛 病"和"羊痊癢病"已得到有效控制，其來源的肝素經(jīng)現(xiàn)有的各種純化技術(shù)可保證安全。
[0003] 根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)牛和羊的飼養(yǎng)量一直高于豬的飼養(yǎng)量， 而豬來源肝素也將無法滿足目前老齡化時(shí)代的醫(yī)療需求。牛和羊?qū)⒈话l(fā)展為低分子肝素類 藥物新的物種來源已是必然。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)亞硝酸降解類低分子肝素藥物物種來源單一性的問題，利用新物種來 源的肝素通過亞硝酸降解制備低分子肝素。 陽00引發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明利用從牛、羊體內(nèi)提取的肝素經(jīng)亞硝酸降解方法制備兩類低分子肝素：那 曲肝素巧與達(dá)肝素鋼，并通過分別與EP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)與抗凝活性的比較，從而初步確定 W上低分子肝素類藥物的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 發(fā)明詳述
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0009] 那曲肝素巧的制備方法，步驟如下：
[0010] (i)將由原料牛肺、牛腸和/或羊腸制備的肝素鋼完全溶解于水中，加入亞硝酸 鋼，肝素鋼為亞硝酸鋼質(zhì)量的10~30倍，調(diào)抑為2~5,反應(yīng)80~120分鐘，然后調(diào)抑至 9~12,制得反應(yīng)液A;
[0011] (ii)向步驟（i)制得的反應(yīng)液A中，加入棚氨化鋼，棚氨化鋼為肝素鋼質(zhì)量的1~ 3%，反應(yīng)4~8小時(shí)，鹽酸調(diào)抑至2~5,混合均勻，再用氨氧化鋼調(diào)至中性，制得反應(yīng)液 B；
[0012] (iii)向步驟（ii)制得的反應(yīng)液B中，加入3~5倍體積的醇，固液分離，干燥，制 得固體A,然后將固體A溶于水中，固體A與水的質(zhì)量體積比為I:巧~10)，單位g/mL，審。 得反應(yīng)液C;
[0013] (iv)將步驟（iii)制得的反應(yīng)液C，通過陽離子交換樹脂將鋼離子置換為巧離子， 制得反應(yīng)液D;
[0014] (V)向步驟（iv)制得的反應(yīng)液D中加入3~5倍體積的醇，充分混合后，固液分 離，經(jīng)純化，干燥，制得低分子肝素。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（i)中，調(diào)抑的酸性抑調(diào)節(jié)劑為鹽酸，堿性抑調(diào)節(jié) 劑為氨氧化鋼。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（iii)、（V)中的醇為甲醇或乙醇。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（iii)、（V)中，固液分離為過濾或離屯、。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（V)中的純化為透析膜透析或醇沉；根據(jù)本發(fā)明優(yōu) 選的，所述步驟（V)中，干燥為-50~-60°C凍干。
[0019] 達(dá)肝素鋼的制備方法，步驟如下：
[0020] (1)將由原料牛肺、牛腸和/或羊腸制備的肝素鋼完全溶解于水中，加入亞硝酸 鋼，肝素鋼為亞硝酸鋼質(zhì)量的30~60倍，調(diào)抑為2~5,反應(yīng)50~120分鐘，然后調(diào)抑至 9~12,制得反應(yīng)液a;
[OOW似向步驟（1)制得的反應(yīng)液a中，加入棚氨化鋼，棚氨化鋼為肝素鋼質(zhì)量的1~ 2%，反應(yīng)6~12小時(shí)，氨氧化鋼調(diào)至中性，制得反應(yīng)液b; 陽02引 做向步驟似制得的反應(yīng)液b中，加入3~5倍體積的醇，固液分離，干燥，制得 固體a,然后將固體a溶于水中，固體a與水的質(zhì)量體積比為1 :巧~10)，單位g/mL，制得 反應(yīng)液C;
[002引 （4)將步驟做制得的反應(yīng)液C，加入體積百分比為0. 8~1. 5%的雙氧水，經(jīng)25~ 30°C氧化10~20小時(shí)，制得反應(yīng)液d;
[0024] 妨向步驟（4)制得的反應(yīng)液d中加入3~5倍體積的醇，充分混合后，固液分離， 經(jīng)純化，干燥，制得低分子肝素。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，調(diào)抑的酸性抑調(diào)節(jié)劑為鹽酸，堿性抑調(diào)節(jié) 劑為氨氧化鋼。
[00%] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)、巧）的醇溶液為甲醇或乙醇。
[0027]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)、巧）中，固液分離為過濾或離屯、。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟巧）中的純化選擇透析膜分別為分子量截留值3000 和8000的超濾膜進(jìn)行超濾純化。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟巧）中，干燥為-50~-60°C凍干。
[0030] 有益效果
[0031] 1、本發(fā)明利用新物種來源肝素通過亞硝酸降解法制備低分子肝素，通過分析新物 種來源的低分子肝素與市場(chǎng)上低分子肝素的結(jié)構(gòu)與活性差異初步確定牛、羊來源低分子肝 素的臨床藥用價(jià)值。本發(fā)明可W從根本上促進(jìn)低分子肝素的物種來源多樣化，拓展肝素類 藥物原料的供應(yīng)，達(dá)到更高程度地穩(wěn)定肝素類與低分子肝素類藥物市場(chǎng)的目的。
[0032]2、本發(fā)明采用牛肺、牛腸和/或羊腸作為原料能夠制備分子量更小的低分子肝 素，因而生物活性更高。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0034] 實(shí)施例和對(duì)比例中所述的原料牛肺，牛腸，羊腸制備的肝素鋼按現(xiàn)有技術(shù)純化制 備，可參見王慶元的《肝素鋼工藝研究》（《中國醫(yī)藥工業(yè)雜志》1991年05期）中描述方法， 制得肝素鋼。 陽0對(duì) 實(shí)施例1
[0036] 牛肺來源肝素鋼制備那曲肝素巧樣品，步驟如下：
[0037] a)將牛肺來源肝素鋼完全溶解于水中，加入亞硝酸鋼，肝素鋼為亞硝酸鋼質(zhì)量的 30倍，調(diào)抑為2. 5,反應(yīng)80分鐘，然后調(diào)抑至10,制得反應(yīng)液A;
[00測(cè) 扣）向步驟a)制得的反應(yīng)液A中，加入棚氨化鋼，棚氨化鋼與肝素鋼的質(zhì)量百分 比為1 %，反應(yīng)6小時(shí)，鹽酸調(diào)抑至3,混合均勻，再用氨氧化鋼調(diào)至中性，制得反應(yīng)液B;
[0039] (iii)向步驟（ii)制得的反應(yīng)液B中，加入4倍體積的乙醇，固液分離，干燥，制得 固體A，然后將固體A溶于水中，固體A與水的質(zhì)量體積比為1 :10,單位g/mL，制得反應(yīng)液 C； W40] (iv)將步驟（iii)制得的反應(yīng)液C，通過陽離子交換樹脂將鋼鹽樣品置換為巧鹽 樣品并保留收集液，制得反應(yīng)液D;
[OOW(V)向步驟（iv)制得的反應(yīng)液D中加入5倍體積的乙醇，充分混合后，固液分離， 將醇沉樣品用透析膜透析或超濾10分鐘或經(jīng)二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C凍 干，制得牛肺那曲肝素巧。 柳42] 實(shí)施例2
[0043] 牛腸來源肝素鋼制備那曲肝素巧樣品，步驟如下：
[0044] (i)將牛腸來源肝素鋼完全溶解于水中，加入亞硝酸鋼，肝素鋼為亞硝酸鋼質(zhì)量的 15倍，調(diào)抑為3,反應(yīng)110分鐘，然后調(diào)抑至10,制得反應(yīng)液A;
[0045] (ii)向步驟（i)制得的反應(yīng)液A中，加入棚氨化鋼，棚氨化鋼與肝素鋼的質(zhì)量百分 比為3%，反應(yīng)4小時(shí)，鹽酸調(diào)抑至3,混合均勻，再用氨氧化鋼調(diào)至中性，制得反應(yīng)液B;
[0046] (iii)向步驟（ii)制得的反應(yīng)液B中，加入4倍體積的乙醇，固液分離，干燥，審U 得固體A，然后將固體A溶于水中，固體A與水的質(zhì)量體積比為1 :8,單位g/mL，制得反應(yīng)液 C；
[0047] (iv)將步驟（iii)制得的反應(yīng)液C，通過陽離子交換樹脂將鋼鹽樣品置換為巧鹽 樣品并保留收集液，制得反應(yīng)液D; W48] (V)向步驟（iv)制得的反應(yīng)液D中加入3倍體積的乙醇，充分混合后，固液分離， 將醇沉樣品用透析膜透析或超濾10分鐘或經(jīng)二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C凍 干，制得牛腸那曲肝素巧。 W49] 實(shí)施例3
[0050] 羊腸來源肝素鋼制備那曲肝素巧樣品，步驟如下：
[0051] (i)將羊腸來源肝素鋼完全溶解于水中，加入亞硝酸鋼，肝素鋼為亞硝酸鋼質(zhì)量的 10倍，調(diào)抑為4,反應(yīng)100分鐘，然后調(diào)抑至10,制得反應(yīng)液A;
[0052] (ii)向步驟（i)制得的反應(yīng)液A中，加入棚氨化鋼，棚氨化鋼與肝素鋼的質(zhì)量百分 比為2%，反應(yīng)5小時(shí)，鹽酸調(diào)抑至4,混合均勻，再用氨氧化鋼調(diào)至中性，制得反應(yīng)液B;
[0053] (iii)向步驟（ii)制得的反應(yīng)液B中，加入3倍體積的乙醇，固液分離，干燥，審U 得固體A，然后將固體A溶于水中，固體A與水的質(zhì)量體積比為1 :6,單位g/mL，制得反應(yīng)液 C；
[0054] (iv)將步驟QiD制得的反應(yīng)液C，通過陽離子交換樹脂將鋼鹽樣品置換為巧鹽 樣品并保留收集液，制得反應(yīng)液D;
[(K)對(duì) （V)向步驟（iv)制得的反應(yīng)液D中加入4倍體積的乙醇，充分混合后，固液分離， 將醇沉樣品用透析膜透析或超濾10分鐘或經(jīng)二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C凍 干，制得羊腸那曲肝素巧。
[0056] 實(shí)驗(yàn)例
[0057] 1.分子量分布檢測(cè)
[0058] 將實(shí)施例1-3制備的S種來源那曲肝素巧和那曲肝素巧EP標(biāo)準(zhǔn)品通過GPC方法 與相應(yīng)軟件計(jì)算分子量分布并對(duì)比。
[0059] 流動(dòng)相：