一種肝癌組織中fgfr3的新型剪接變異體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肝癌組織中FGFR3的新型剪接變異體及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性肝臟疾病是危害我國人民健康的重大公共衛(wèi)生問題之一，在我國導(dǎo)致死亡的 主要原因中占第六位，人群中己型肝炎病毒皿V攜帶率為9. 09%，其中慢性己型肝炎患者 約5000萬，肝臟炎癥的反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致10%~20%的患者發(fā)展為肝硬化，其中10%~15% 的肝硬化患者最終發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌。除了肝癌的危害W外，肝炎一肝硬化一肝癌的轉(zhuǎn)化 過程中的各個階段都會對患者的健康和生命造成嚴(yán)重危害，對我國產(chǎn)生了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) 和社會問題。目前有關(guān)己型肝炎一肝硬化一肝癌病變機(jī)制的研究主要包括己肝易感因素的 研究、疫苗保護(hù)效率和失敗原因、慢己肝抗病毒治療反應(yīng)的宿主細(xì)胞的反應(yīng)、導(dǎo)致肝纖維化 和肝硬化進(jìn)展的宿主因素、肝癌發(fā)生發(fā)展的遺傳及環(huán)境因素等。在臨床診斷和治療方面，我 國目前尚缺乏有效、特異、具有指導(dǎo)性意義的分子標(biāo)識物，W及相應(yīng)的診斷、治療及其預(yù)后 檢測手段，尤其在特異性藥物的研究方面更是嚴(yán)重地滯后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服上述缺點(diǎn)，提供一種肝癌組織中FGFR3的新型剪接變異體及 其應(yīng)用，該新型變異體可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，表明該新型變異體能作為肝癌的診斷 標(biāo)志物。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0005] 一種肝癌組織中FGFR3的新型剪接變異體，所述新型剪接變異體為FGFR3A7 所 述FGFR3&7 9的基因序列為：
[0006] CGCTGGACGTGCTGGCCGAGGAGGAGCTGG。
[0007] 進(jìn)一步地，所述FGFR3&7e是將肝癌組織RNA逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物經(jīng)過巢式PCR擴(kuò)增反 應(yīng)得到。
[000引進(jìn)一步地，所述巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物兩對PCR引 物，所述外側(cè)引物的上游引物序列為；5' -CGTCGTGGAGAACAAGTTTGG-3'，所述外 側(cè)引物的下游引物序列為；5' -GGAAGCGGGAGATCTTGTG-3';所述內(nèi)側(cè)引物的上游 引物序列為；5' -AGCATCCGGCAGACGTACAC-3'，所述內(nèi)側(cè)引物的下游引物序列為 5' -GCCACCACCAGGATGAACAG-3'。
[000引一種上述新型剪接變異體FGFR3&7e的巢式PCR引物，所述巢 式PCR引物包括外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物兩對PCR引物，所述外側(cè)引物的上 游引物序列為；5' -CGTCGTGGAGAACAAGTTTGG-3'，所述外側(cè)引物的下游引 物序列為；5' -GGAAGCGGGAGATCTTGTG-3';所述內(nèi)側(cè)引物的上游引物序 列為；5' -AGCATCCGGCAGACGTACAC-3'，所述內(nèi)側(cè)引物的下游引物序列為 5' -GCCACCACCAGGATGAACAG-3'。
[0010] 新型剪接變異體FGFR3&7g在制備肝癌的診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過將肝癌組織中提取出的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增反應(yīng)處理，得到FGFR3的新型剪接變異體FGFR3&7e;通過實(shí)驗(yàn)顯示，新型剪接變異體 FGFR3&7e可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并能促進(jìn)裸鼠皮下肝癌細(xì)胞移植瘤的生長，該實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明FGFR3&7g可作為肝癌的診斷標(biāo)志物，因此，檢測肝癌患者組織中是否存在剪接變 異體FGFR3&7 9對判斷肝癌的預(yù)后有著較高的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0012] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用 的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可W根據(jù)送些附圖獲得其他 的附圖。
[0013] 圖1是本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；
[0014] 圖2是本發(fā)明中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序圖；
[001 引 圖 3 是本發(fā)明中穩(wěn)定表達(dá)FGFR3"ic，F(xiàn)GFR3&79和FGFR3AT-iHepG2/SMMC-7721 細(xì)胞 的CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)圖；
[0016] 圖4是本發(fā)明中FGFR3&7 9促進(jìn)化PG2/SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的表示圖；
[0017] 圖5是本發(fā)明中FGFR3&7 9對腫瘤生長的影響的表示圖；
[001引圖6是本發(fā)明中FGFR3&7 9對肝癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的影響的表示圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0020]1、肝癌組織中RNA抽提
[0021] 采用化izol試劑抽提，具體步驟如下：
[0022] (1)從-7(TC中冰箱中取出臨床肝癌組織標(biāo)本等正常對照標(biāo)本塊，取出50mg加入 曾在Depc水浸泡并高溫高壓過的玻璃勻漿器中，迅速往勻漿器中加入ImlTrizol試劑，手 動研磨，所有操作都要在冰上，每例標(biāo)本研磨時間控制在6minW內(nèi)；
[002引 似研磨后將勻漿器中的所有液體轉(zhuǎn)移到1. 5mlEP管中，冰上靜置5min;
[0024] (3)加入0. 2ml氯仿（每ImlTrizol試劑），劇烈振蕩混合15s;
[00幼 （4)室溫下靜置3min;
[002引 妨12, 000g，4°C離必15min，小必吸取上清液；
[0027] (6)加入異丙醇0. 5ml(每ImlTrizol試劑），顛倒混勻；
[002引 （7)室溫下靜置IOmin;
[0029] 做 12,OOOg, 4°C離必IOmin;
[0030] (9)見管底白色RNA沉淀，棄上清液，加入lml75%己醇-DEPC溶液洗涂；
[0031] (10)7, 500g，4°C離必 5min;
[003引（11)棄去己醇，干燥RNA沉淀，約5-lOmin;
[0033] (12)DEPC-H2O溶解RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度；
[0034] (13)調(diào)整RNA濃度至 0. 5Ug/U1。
[00對2、逆轉(zhuǎn)錄
[0036]采用ReverseTranscriptionSystem(美國Promega公司），具體操作如下：
[0037] (1)冰上融解RNA,在室溫下融解RTBuffer,RNase-freewater;
[003引似冰上建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20U1:
[0039] 八：DKPC-I似） 8. 9 1-1 1 RNA (1Ug/U1) 1 口 1 B:: IQX 腳BWfer 2 P l
[0040] dNTP (IOmM) 2 Ii 1 M典12 (化nM) 4 Wl Oligo (dT) 15 動物（化島H宮/ U 1) 1 1x1 Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 P1 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（20u/ U 1) 0.6 P l 總體積 細(xì)W 1
[00川（3)PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，兩步法，按照W下條件處理：
[0042] A：70°C,IOmin；4°C,IOmin；
[0043]B加入處理過的A中混勻；42°C，15min;95°C，5min;4°C，保存；
[0044] 反應(yīng)后獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA，于-20°C保存，準(zhǔn)備進(jìn)行RT-nestPCR。
[004引3、巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0046]巢式PCR(nestedPCR)，是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò) 增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用W產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第 二輪擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個祀位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c 兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配 對，增加了檢測的可靠性。由于研究發(fā)現(xiàn)FGFR3在肝癌組織及細(xì)胞中表達(dá)量較低，所W使用 RT-nestPCR進(jìn)行擴(kuò)增，我們利用01igo6. 0自行設(shè)計引物兩對FGFR3(F1) -FGFR3巧1)、 FGFR3 (F2) -FGFR3巧2)，其中前者為外側(cè)特異引物，后者為內(nèi)側(cè)特異引物，它們橫跨FGFR3 外顯子6至外顯子10,我們用外側(cè)引物合成的PCR產(chǎn)物作為模板，W內(nèi)側(cè)引物為引物進(jìn)行二 次巢氏PCR擴(kuò)增，我們使用Promega的高效GotaqDNA聚合酶建立25U1RT-nestPCR體 系，詳細(xì)步驟過程反應(yīng)條件如下：
[0047] 牌―nest P嫌IRT- nest PCR I condition: 10XBuf:f'er: 5 U I Step I: 94° C--5min MgCU: 3 HlStop2: 94。C--30s 10 mM dNTP: 0. Sn I Step 3: 60。C--30s 12. 5 uM primerCFU : 0. 5 P I Step 4: 72° C--45s 12. 5 PM prl阻er'(反i) : O',技'ul StepS: turn to Step2, 28 cycles. Taq: 0.1 I Step 6: 72° C -'-IQmin (ldHoO: 14. 4 U I btep 7: 4° C 5niin cDNA: Iul
[0048] total volura 25 P I
[0049] 腳-賊P雄2::' RT- nest PGR2condition: IOXBuffer: Swl Step 1：: 94° --5min MgCL：. 3 Ul Step 2: 94。C--30s 10nilclMP: 0.r)y.ISt叩 3: 60。C--30s 12:. 5 H M primer (F2) : 0. 5 U I Step 4: 72° C--45s 12.5 U M primer (R2) : 6.日u I Step己：turn to Step2, 28 cycles Taq: 0.1 U I Step 6: 72。C--IOmin d地20: I生.4 U I Step 7: 4° C--:反min cDNA: I til totalVOIUiIi25yI
[0050] 其中，F(xiàn)GFR3巢式PCR引物序列為：
[0051] 外側(cè)引物的上游引物FGFR3 (Fl)
[0052] 外側(cè)引物的下游引物FGFR3巧1)
[0053] 內(nèi)側(cè)引物的上游引物FGFR3 (F2)
[0054] 內(nèi)側(cè)引物的下游引物FGFR3巧2)
[0055] 4、擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后行目的基因切膠回收
[0056] (1)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳：
[0057] 曰、準(zhǔn)確稱取瓊脂糖0.Sg;
[0058] b、將瓊脂糖溶于40ml1XTAE溶液，微波爐加熱至沸騰，使瓊脂糖完全溶解；
[0059] C、上述溶液冷卻至6(TC時，加入1. 5y1EB，混勻后倒入準(zhǔn)備好的凹槽中，插入上 樣孔梳子，待其自然冷卻；
[0060] d、拔出梳子，將凹槽置入電泳槽，1XTAE溶液作為電泳緩沖液。每孔加入PCR產(chǎn)物 20U1+上樣緩沖液1U1，IOOV電壓下電泳30min;
[0061]e、將溶解后的凝膠移入QIAquickspin柱，13, 000巧