驗：分別選取4個稀釋度的陽性標準品為模板，同一反 應條件下進行3次獨立的TaqMan熒光定量PCR試驗，每次試驗間隔7天；批內重復性試驗： 分別選取5個稀釋度的陽性標準品為模板，每個稀釋度設3個重復，同一條件下進行TaqMan 熒光定量PCR試驗。
[0054] (IV)臨床樣品的檢測，利用上述實施例涉及的方法分別對江蘇大豐地區(qū)某魚塘采 集的異育銀鯽樣品進行檢測，同時設立陰陽性對照。
[0055] 以實施例7為例，對該實施例中TaqMan熒光定量PCR反應條件進行優(yōu)化，如下所 示： 熒光PCR反應條件優(yōu)化選用終濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0μmol/L的引物（上游 引物F、下游引物R)濃度和0.4,0.6ymol/L的探針P濃度，采用矩陣法檢測篩選引物和 探針P的最佳反應濃度。試驗結果表明，采用0.4μmol/L的引物和0.6μmol/L的探針 終濃度，檢測獲得的Ct值最小、熒光擴增曲線最典型而ARn值較大，從而確定其為最佳引 物和探針濃度，如圖1所示。優(yōu)化后的反應程序：95°C1min;95°C5s，58°C30s，45 個循環(huán)，在退火階段收集熒光信號，如圖2所示。
[0056]圖 1 中，1.c(引物）=0· 4ymol/L，c(探針）=0· 6ymol/L;2.c(引物）=0· 4 ymol/L，c(探針）=0.4ymol/L;3.c(引物）=0.6ymol/L，c(探針）=0.6ymol/L;4. c(引物）=0.6ymol/L，c(探針）=0.4ymol/L;5.c(引物）=0.8ymol/L，c(探針） =0.6ymol/L;6.c(引物）=0.8ymol/L，c(探針）=0.4ymol/L;7.c(引物）=1.0 ymol/L，c(探針）=0.4ymol/L;8.c(引物）=1.0ymol/L，c(探針）=0.6ymol/L; 9.c(引物）=0.2ymol/L，c(探針）=0.6ymol/L;8.c(引物）=0.2ymol/L，c(探 針）=0· 4μmol/L。
[0057]圖 2 中，1 :58. 2°C;2 :56. 6°C;3 :60· 1Γ;4 :55°C;5 :61. 7°C;6 :60. 1°C;7 :63°C; 8 ：62. 6°C；9 ：NTC〇
[0058] 該實施例中，基因片段的擴增及重組質粒標準品的制備情況如下：采用熒光定量 PCR的上游引物F、下游引物R進行常規(guī)PCR，得到大約83bp的目的片段，如圖3所示，構建 的重組質粒標準品核苷酸測序結果經BLAST比對，顯示其插入的基因片段與參考片段同源 性達100%，說明成功構建了陽性標準品。標準品經implen超微量分光光度計測濃度，換算 成拷貝數為3. 77X1011拷貝/μL。
[0059] 圖 3 中，1 :無模板對照；2:PCR產物；M:DL2000DNAMarker，l:NTC； 2:PCR product；M:DL2000DNAMarker〇
[0060] 該實施例中，TaqMan熒光定量PCR的反應條件：優(yōu)化后的TaqMan熒光定量PCR反 應體系（25yL):2XPremixExTaq(ProbeqPCR) 12.5yL，上下游引物（10ymol/L)各 1.0μL，探針（10μmol/L) 1.5μL，質粒標準品2μL，補水至終體積25μL。優(yōu)化后的 反應條件：95°C1min;95°C5s，58°C30s，45 個循環(huán)。
[0061] 該實施例中，TaqMan熒光定量PCR的標準曲線制作：以10倍連續(xù)梯度稀釋 (10 3~10 9)的陽性標準品為模板進行TaqMan熒光定量PCR，得到檢測異育銀鯽皰疹 病毒2型的標準曲線，如圖4所示。結果顯示TaqMan熒光定量PCR在3. 77X10s拷 貝/yL~3. 77X102拷貝/ 范圍內，擴增效率為96%，標準曲線的線性回歸方程為 尸-2. 9311+1. 542, /=0· 995,具有良好的線性關系。
[0062] 對該實施例中TaqMan熒光定量PCR檢測方法進行評價： 敏感性試驗：將10倍連續(xù)梯度稀釋好的陽性標準品，3. 77X10s拷貝/ #L~3. 77X102 拷貝/ #L進行TaqMan熒光定量PCR，3. 77X10s拷貝/ #L~3. 77X102拷貝/ #L進行常規(guī) PCR，結果見圖5,TaqMan熒光定量PCR檢測的最低靈敏度37. 7拷貝/ #L，常規(guī)PCR檢測的 最低靈敏度3. 77X103拷貝/ #L。TaqMan熒光定量PCR的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍。
[0063] 圖5中，A:CyHV_2TaqMan熒光定量PCR;B:常規(guī)PCR; 1~7 :標準品的基因拷貝 數分別為，77X108 拷貝 /μL~3. 77X102 拷貝 /μL;8 :陰性對照。A:CyHV-2TaqMan fluorescentquantitativePCR;B:PCR; 1 ~7:Theplasmidconcentrationsof1~7were 3.77X107copies/#L~3.77X10copies/#L;8:Negativecontrol〇
[0064] 特異性試驗：分別檢測CyHV-2、ISAV、IHNV、KHV和SVCV，共5種病毒，結果顯示，只 有檢測CyHV-2時出現(xiàn)擴增曲線，如圖6所示。
[0065] 重復性試驗：取37. 7/4拷貝/#L~3. 77X106拷貝/ 之間梯度稀釋的標準品質 粒，分別進行3次批內及批間重復性試驗，結果見表1和表2,批內及批間的變異系數（〇0 均小于1%。
[0066] 表1批內重復性試驗
表2批間重復性試驗
對臨床樣品的檢測：利用本實施例的方法和PCR方法分別對32份異育銀鯽樣品進行檢 測，其中熒光定量PCR檢測時，樣品的值大于其敏感度試驗中最大的值時視為檢測陰 性。PCR檢出陽性樣品28份，TaqMan熒光定量PCR檢出陽性樣品32份，PCR檢出的陽性 樣品用熒光定量PCR檢測時均為陽性，具體檢測結果見表3。
[0067] 表3分別用TaqMan熒光定量PCR和PCR對臨床病料進行檢測
綜上所述，本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法靈敏度高，特異性強，能快速檢測到極低含 量的病毒，為病毒檢測和定量提供了一種切實可行的方法。與已報道的方法相比，該方法不 僅簡單、快速，而且準確、靈敏、檢出限低。該方法能快速、準確測定患病魚體組織中的病毒 含量。方法所用試劑簡單、微量，設備簡單，操作簡便、快速。
【主權項】
1. 一種鯉皰疹病毒II型實時熒光PCR檢測方法，其特征在于：包括提取病毒 樣品中CyHV-2病毒的DNA，進行實時熒光PCR擴增檢測，其中，上游引物F:5z-CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG-3 ' 下游引物R:5z-CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3 ' 探針P: 5zFAM-TTGTACCAGCACTCGCCAATGAGCA-BHQ3z。2. 根據權利要求1所述的一種鯉皰疹病毒II型實時熒光PCR檢測方法，其特征在 于：用磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒提取所述病毒樣品中CyHV-2病毒的DNA，并置 于-80~-20°C的溫度下保存?zhèn)溆谩?. 根據權利要求1所述的一種鯉皰疹病毒II型實時熒光PCR檢測方法，其特征在于： 在所述實時熒光PCR擴增檢測中，擴增片段為83bp，擴增體系為20~50μL。4. 根據權利要求1所述的一種鯉皰疹病毒II型實時熒光PCR檢測方法，其特征在于： 所述實時熒光PCR的擴增反應條件包括：94~95°C1~3min，95°C5~15s、56~58°C 30~40s、72°C20~30s，循環(huán)35~45次，檢測設立陽性對照和陰性對照，所述陽性對 照為陽性質粒標準品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鯉皰疹病毒II型實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒樣品中CyHV-2病毒的DNA，進行實時熒光PCR擴增檢測，其中，上游引物F：5ˊ-CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG-3ˊ，下游引物R：5ˊ-CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ，探針P：5ˊFAM-TTG？TAC？CAG？CAC？TCG？CCA？ATG？AGC？A-BHQ？3ˊ。本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法與已報道的方法相比，不僅簡單、快速，而且準確、靈敏、檢出限低，該方法能快速、準確測定患病魚體組織中的病毒含量，所用試劑簡單、微量，設備簡單，操作簡便、快速。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公開號】CN105274257
【申請?zhí)枴緾N201510768790
【發(fā)明人】佘容, 林華, 羅丹, 郝中香, 張鳳枰, 陳世界, 劉耀敏, 楊苗, 盛毅
【申請人】通威股份有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月12日