一種石蠟dna純化方法及其在基因組學(xué)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種石蠟DNA純化方法，以及該方法在基因組學(xué)中的應(yīng)用，尤其是涉 及從石蠟包埋的人類組織樣本中純化DNA的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組學(xué)的快速發(fā)展為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)帶來契機(jī)。以腫瘤個體化治療為例，醫(yī)院病理 科保存的腫瘤石蠟標(biāo)本是尋找藥物靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)癌癥患者精準(zhǔn)醫(yī)療的前提。然而，石蠟標(biāo)本 在制作過程中所經(jīng)歷的處理過程（如福爾馬林浸泡、石蠟包埋等）是導(dǎo)致石蠟DNA高度 降解的主要原因。降解后的石蠟DNA只能有限度的應(yīng)用于腫瘤基因組學(xué)研究DNA質(zhì) 量差（260/280比值偏高或偏低，雜質(zhì)多等），DNA需要量大（3-10微克），PCR循環(huán)次數(shù)大 (12-18)，二代測序后接受比例低（20-50% )(W.N,等，High-throughputdetectionof actionablegenomicalterationsinclinicaltumor,CancerDiscov2 (2012)82-93. 以及G.H,等，Genome-scaleDNAmethylationmappingofclinicalsamplesat single-nucleotideresolution,NatMethods7(2010) 133-136·)。這些因素極大的阻礙 了腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。因此，非常有必要針對石蠟樣本DNA提取的流程和純化進(jìn)行優(yōu)化， 為實(shí)現(xiàn)基因組學(xué)助力精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供充裕的材料基礎(chǔ)。
[0003] 醫(yī)院病理科石蠟包埋腫瘤組織的處理步驟如下：1、固定；2、水洗；3、脫水；4、透 明；5、浸蠟；6、包埋；7、切片。病理科大夫根據(jù)石蠟切片來源的HE染色、免疫組化、免疫熒 光等最終判斷疾病的性質(zhì)和程度。在這個一系列的處理過程中，包埋在石蠟塊中的腫瘤組 織DNA不可避免的經(jīng)歷了多重?fù)p傷；這也是石蠟DNA之所以高度降解的根本原因。
[0004] 現(xiàn)已有一些文獻(xiàn)報道了石蠟樣本DNA提取的方案，一般是基于硅吸附的提取流 程。在我們前期的摸索階段，發(fā)現(xiàn)這些方案提取的石蠟DNA存在產(chǎn)量低，質(zhì)量差的普遍特點(diǎn) (Fassunke,J. ,etal. ,Utilityofdifferentmassiveparallelsequencingplatforms formutationprofilinginclinicalsamplesandidentificationofpitfallsusing FFPEtissue.IntJMolMed, 2015)。目前，尚未有針對石蠟切片制作全流程的針對性方案 來提高DNA提取的產(chǎn)量和質(zhì)量。因而，我們在后續(xù)的設(shè)計策略上著重全面考慮腫瘤石蠟樣 本所經(jīng)歷的制片過程，針對性的解除或降低這些過程對DNA的降解，從而達(dá)到提高石蠟樣 本DNA產(chǎn)量和質(zhì)量的最終目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種石蠟包埋樣本中的DNA提純方案，使其適用于大規(guī)模基 因組學(xué)研究，為實(shí)現(xiàn)腫瘤患者的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)奠定材料基礎(chǔ)。
[0006] 為此，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] -種石蠟包埋樣本中的DNA提純方法，所述方法包括（1)對樣本進(jìn)行脫蠟；（2)去 除樣本中的甲醛；（3)細(xì)胞裂解；（4)提取DNA; (5)去除DNA與蛋白質(zhì)的粘連；（6)純化DNA， 其中，所述步驟（1)包括用二甲苯對樣本進(jìn)行脫蠟。
[0008] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，重復(fù)多次用二甲苯對樣本進(jìn)行脫蠟。
[0009] 更優(yōu)選的，二甲苯對樣本進(jìn)行2-3次脫蠟。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟⑵中包括使用硼氫化鈉將甲醛還原為甲醇。
[0011] 更優(yōu)選的，所述硼氫化鈉的濃度為〇. 1-1. 0M。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟（5)中包括使用去交聯(lián)劑以去除DNA與蛋白質(zhì)的粘連。
[0013] 更優(yōu)選的，所述去交聯(lián)劑包括但不僅限于：SDS和NaHC03。
[0014] 優(yōu)選的，所述方法步驟（5)中還包括聯(lián)合使用蛋白酶K以去除DNA與蛋白質(zhì)的粘 連。
[0015] 更優(yōu)選的，所述蛋白酶K添加量為20-40μ1。更優(yōu)選為，蛋白酶K在60-65°下水 浴。
[0016] 本發(fā)明還提供一種上述任一方法在基因組學(xué)中的應(yīng)用。
[0017] 使用本發(fā)明的方法針對石蠟包埋的DNA可能遭受的束縛和損傷，進(jìn)行了相應(yīng)的改 善。我們的策略：基于石蠟標(biāo)本制作流程中DNA受損點(diǎn)，針對性地設(shè)計相應(yīng)方案。利用本發(fā) 明的方法制備得到的DNA樣本接近新鮮樣本的基因組表現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明的技術(shù)效果 是：1、通過增加二甲苯脫蠟的次數(shù)，減少石蠟的含量，從而減少石蠟對DNA的損傷和束縛； 2、用硼氫化鈉將甲醛還原為甲醇，并蒸發(fā)，解除了甲醛對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的固定，減少甲醛對細(xì)胞 的約束，從而提高石蠟DNA的產(chǎn)量；3、在優(yōu)選的方案中，使用去交聯(lián)溶液，減少初提DNA與蛋 白的交聯(lián)，徹底釋放DNA，提尚石錯DNA質(zhì)量；4、聯(lián)合加大蛋白酶Κ用量，提尚水浴溫度，促 進(jìn)蛋白降解，減少對DNA的污染。通過多方案、長時間的優(yōu)化和改進(jìn)，我們提取的石蠟標(biāo)本 DNA的基因組學(xué)表現(xiàn)明顯強(qiáng)于已有方案，已非常接近于新鮮樣本的基因組學(xué)表現(xiàn)。在同等起 始石蠟材料和同時提取流程下，我們的方案能提取數(shù)量更大，質(zhì)量更高的石蠟DNA。更為重 要的是，后續(xù)基因組學(xué)應(yīng)用進(jìn)一步證實(shí)了這些石蠟DNA的測序質(zhì)量堪比新鮮樣本。為大規(guī) 模開展腫瘤患者的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)鋪墊了材料基石。
【附圖說明】
[0018] 圖1實(shí)施例1的DNA電泳結(jié)果圖；
[0019] 圖2 :實(shí)施例2的DNA電泳結(jié)果圖；
[0020] 圖3 :實(shí)施例3的DNA電泳結(jié)果圖；
[0021] 圖4 :實(shí)施例4的基因組測序質(zhì)量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。可以理解的是，在 此描述的特定實(shí)施方式通過舉例的方式來表示，其并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離于 本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會 意識到或能夠確認(rèn)，僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，許多等同物都能應(yīng)用于本文所描述的特定步驟中。 這些等同物被認(rèn)為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。
[0023] 本發(fā)明的實(shí)施例涉及表1所示的試劑盒
[0024] 表1:試劑盒信息
[0025]
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 1.將腎癌石蠟樣本（石蠟肩）室溫（20-25° )放置2小時。
[0028] 2.稱量彡25mg石蠟肩組織，放入2mlEP管。
[0029] 3.加入1200ul二甲苯；震蕩混勻10秒；放旋轉(zhuǎn)儀10分鐘，室溫。
[0030] 4.離心，10000G，70 秒，室溫。
[0031] 5.棄上清。
[0032] 6.重復(fù)步驟3-5-次。
[0033] 7.加入1200ul100%乙醇，震蕩混勻15秒。
[0034] 8.離心，11000G，70 秒，室溫。
[0035] 9.棄上清（不要移除任何沉淀）。
[0036] 10.重復(fù)步驟7-9-次。
[0037] 11. 37。水浴 2mlEP管 30 分鐘。
[0038] 12.加1001110.說，0.21，0.51或者1.01硼氫化鈉溶液（分別設(shè)為第2,3,4,5 組）。
[0039] 13. 50°水浴2mlEP管30分鐘。（對照組不添加硼氫化鈉，無步驟12和13,設(shè)定 為第1組）
[0040] 14.加180ulATL，40ul蛋白酶K;震蕩混勻20秒。
[0041] 15. 61. 5°水浴48-72小時，至液體透明（期間取出EP管并震蕩3-5次）。
[0042] 16.加 200ulAL，震蕩混勻 20 秒。
[0043] 17. 70。水浴 10 分鐘。
[0044] 18.加200ul無水乙醇，震蕩混勻20秒，稍離心。
[0045] 19.將EP管內(nèi)所有混合物轉(zhuǎn)移至QIAampMinispincolumn(套在2ml收集管）。
[0046] 20.離心，6000g，1分鐘；棄流出液，換2ml收集管。
[0047] 21.加500ulAW1 ;離心，7000g，1分鐘；棄流出液，換2ml收集管。
[0048] 22.加500ulAW2 ;離心，8000g，1分鐘；棄流出液，換2ml收集管。
[0049] 23.離心，9000g，1分鐘；棄流出液。
[0050] 24.柱子開蓋，室溫放置10分鐘；之后柱子放入新1. 5mlEP管。
[0051] 25.加入50ul的60°預(yù)熱無核酸酶水，室溫1分鐘。
[0052] 26.離心，12000g, 1分鐘。
[0053] 27.重復(fù)步奏25-26 -次；得到100ul含DNA的洗脫液。
[0054] 28.初步定量：用NanoDrop和1 %凝膠電泳圖（見圖1)。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組2-5 的DNA條帶明顯多于對照組1，濃度也高于對照組。DNA定量結(jié)果見表2。如表2所示，添加 NaBH4的實(shí)驗(yàn)組（包括第2-5組）得到的DNA濃度明顯高于對照組，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異， 并且各個實(shí)驗(yàn)組得到的DNA質(zhì)量也明顯優(yōu)于對照組。
[0055] 表2:對照組和實(shí)驗(yàn)組DNA定量結(jié)果
[0056]
[0057] 實(shí)施例2
[0058] 1.將腎癌石蠟樣本（石蠟肩）室溫（20-25° )放置2小時。
[0059] 2.稱量彡25mg石蠟肩組織，放入2mlEP管。
[0060] 3.加入1200ul二甲苯；震蕩混勻15秒；放旋轉(zhuǎn)儀10分鐘，室溫。
[0061] 4.離心，10000G，70 秒，室溫。
[0062] 5.棄上清。
[0063] 6.重復(fù)步驟3-5二次。
[0064] 7.加入1200ul100%乙醇，震蕩混勻15秒。
[0065] 8.離心，11000G，70 秒，室溫。
[0066] 9.棄上清（不要移除任何沉淀）。
[0067] 10.重復(fù)步驟7-9-次。
[0068] 11. 37。水浴 2mlEP管 30 分鐘。
[0069] 12.加入100ul0. 2M硼氫化鈉溶液。
[0070] 13. 50。水浴 2mlEP管 30 分鐘。
[0071] 14.加180ulATL，40ul蛋白酶K;震蕩混勻20