一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法，屬于顯微組織切片【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括組織固定、組織脫水、組織透明、浸蠟、包埋與切片、展片與粘片、脫蠟和組織復(fù)水等步驟，操作簡單、耗時短，最終切片對組織區(qū)分度高，能觀察到蟲體完整的空間結(jié)構(gòu)，適用于身體柔軟、液體含量高、腔室比例大的幼蟲蟲體材料。采用該方法處理3齡棉鈴蟲幼蟲蟲體，在明場下觀察其體壁完整，體腔內(nèi)部的肌肉組織、神經(jīng)組織等分布其間，占身體比例大的消化道結(jié)構(gòu)清晰完整，一對腹足的空間結(jié)構(gòu)正常；在藍光激發(fā)下，能夠觀察到各器官組織被激發(fā)的自發(fā)綠色熒光水平。
【專利說明】一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法，屬于顯微組織切片【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲石蠟切片技術(shù)是研究昆蟲組織形態(tài)及組織病理的重要實驗技術(shù)，一般包括解剖、固定、脫水透明、包埋、切片等步驟。昆蟲外骨骼較為堅硬，難以制作完整的石蠟切片，目前昆蟲石蠟切片方法多數(shù)用于昆蟲的局部組織或器官(如觸角、消化道、足等)，這樣不能觀察到昆蟲整體的顯微結(jié)構(gòu)。昆蟲幼蟲柔韌的體壁包裹著開放流動的血淋巴和體液,血淋巴和體液中從頭部至尾部貫穿著管狀消化道，消化道相對體積較大，消化道內(nèi)由昆蟲攝取的食物填充，食物水分含量高。針對這種身體柔軟、液體含量高、腔室比例大的幼蟲蟲體材料，目前常規(guī)的切片方法不僅操作復(fù)雜，需要耗費較長時間，且常使用毒性大的二甲苯等化學(xué)物質(zhì)，更重要的是最終固定、包埋、切片等的效果不夠理想，最終切片對組織區(qū)分度十分有限，尤其是占蟲體比例非常大的消化道容易變形或破碎，難以觀察到蟲體完整空間結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法。
[0004]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法，包括以下步驟:
[0006](I)組織固定:
[0007]取昆蟲蟲體浸于組織固定液中，抽真空并保持負(fù)壓10?30分鐘(使蟲體完全沉至底部)，再于4°C下靜置10?14小時；
[0008](2)組織脫水:
[0009]取組織固定后的蟲體，4°C條件下，依次用濃度梯度為50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間至少為I小時；
[0010](3)組織透明:
[0011]取組織脫水后的蟲體，室溫下在組織透明劑中浸泡5?9小時(每1.5?2小時更換組織透明劑一次);
[0012](4)浸蠟、包埋與切片:
[0013]取組織透明后的蟲體，在65°C的液體石蠟中浸泡7?9小時，凝固定型后切片；
[0014](5)展片與粘片:
[0015]取切片移至載玻片上，在切片邊緣滴加60°C的蒸餾水至切片完全展開，再置于30?37°C條件下10?14小時粘片；
[0016](6)脫蠟和組織復(fù)水:
[0017]取組織透明劑滴加在切片組織上，保持至少20分鐘后吸走，重復(fù)至少按此，再依次滴加濃度梯度為100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每個梯度的處理時間為I?5分鐘。[0018]所述步驟(I)中的組織固定液為:取IOOmL PBS緩沖液，調(diào)節(jié)緩沖液pH值至
10.5?11.5，加熱至65?75°C，加入多聚甲醛至終濃度為4%，待溶解完全后冷卻，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5?7.5，再加入30 μ L吐溫-20或吐溫Χ-100，冷卻至4°C備用。固定液的用量與蟲體的體積比為20:1。
[0019]所述的PBS 緩沖液的組成為:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 IOmmol/L, KH2PO4 2mmol/L, pH 值為 5 ?7。
[0020]所述步驟(I)中負(fù)壓的壓力值為-1.0KPa0
[0021]所述步驟(2)中乙醇用量與蟲體的體積比為20:1 ;每個梯度的處理時間優(yōu)選為I小時。
[0022]所述步驟(2 )中組織脫水步驟為:
[0023]I) 4°C條件下，50%乙醇中保持Ih,
[0024]2) 4°C條件下，60%乙醇中保持Ih,
[0025]3) 4°C條件下，70%乙醇中保持Ih (此步驟可長期存放)，
[0026]4) 4°C條件下，90%乙醇中保持Ih,
[0027]5)4°C條件下，無水乙醇中保持lh，
[0028]6)4°C條件下，無水乙醇中保持lh，
[0029]7)4°C條件下，無水乙醇中保持lh。
[0030]所述步驟(3 )中組織透明步驟為:
[0031 ]I)室溫條件下，組織透明劑中浸泡I.5?3小時，
[0032]2 )室溫條件下，組織透明劑中浸泡1.5?3小時，
[0033]3 )室溫條件下，組織透明劑中浸泡2?3小時。
[0034]所述步驟I)、2 )中的浸泡時間優(yōu)選1.5小時，步驟3 )中的浸泡時間優(yōu)選2小時。
[0035]所述的組織透明劑為Histo-Clear，型號為SG HS-200，購自美國NationalDiagnotics 公司。
[0036]所述步驟(4)中浸蠟步驟為:
[0037]I)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時，
[0038]2)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時，
[0039]3)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時，
[0040]4)浸入液體石臘，65°C浸泡2小時。
[0041]所述步驟(4)中將第四次的石蠟連同蟲體組織一起倒入包埋盒中，迅速調(diào)整蟲體在石蠟中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋。
[0042]所述步驟(6)中脫蠟和組織復(fù)水步驟為:
[0043]I)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0044]2)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0045]3)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0046]4)將無水乙醇滴加在切片組織上,保持Imin,再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0047]5)將無水乙醇滴加在切片組織上,保持Imin,再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0048]6)將95%乙醇滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0049]7)將85%乙醇滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走，[0050]8)將70%乙醇滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0051]9)將50%乙醇滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0052]10)將30%乙醇滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走，
[0053]11)將無菌水滴加在切片組織上，保持lmin，再用吸水紙在切片邊緣吸走。
[0054]本發(fā)明的有益效果:
[0055]本發(fā)明中昆蟲幼蟲石蠟切片方法，操作簡單、耗時短，最終切片對組織區(qū)分度高，能觀察到蟲體完整的空間結(jié)構(gòu),適用于身體柔軟、液體含量高、腔室比例大的的幼蟲蟲體材料。采用該方法處理3齡棉鈴蟲幼蟲蟲體，在明場下觀察其體壁完整，體腔內(nèi)部的肌肉組織、神經(jīng)組織等分布其間，尤其是占身體比例非常大的消化道結(jié)構(gòu)清晰完整，甚至一對腹足也空間結(jié)構(gòu)正常；在藍光激發(fā)下，能夠觀察到各器官組織被激發(fā)的自發(fā)綠色熒光水平。本發(fā)明昆蟲整體石蠟切片方法即可以彌補局部觀察的不足，還可以進行免疫酶染色和原位雜交等組織定位，為昆蟲生理、病理學(xué)等方面的研究提供新的試驗方法。
[0056]本發(fā)明在組織透明步驟中采用Histo-Clear組織透明劑，在處理組織切片時不需要吸入有毒的二甲苯，安全性高，透明處理效果好。Histo-Clear處理的樣本沒有二甲苯處理的硬和脆，方便切成更薄的切片，并且延長了切片刀片的壽命。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1為本發(fā)明實施例1中棉鈴蟲3齡幼蟲蟲體腹節(jié)橫切面切片。
【具體實施方式】
[0058]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0059]實施例1
[0060]本實施例中昆蟲幼蟲石蠟切片方法，包括以下步驟:
[0061]1、組織固定
[0062]在化學(xué)通風(fēng)柜中配制4%的多聚甲醛溶液作為組織固定液，固定液現(xiàn)配現(xiàn)用，組織固定液配制流程為:在100毫升PBS緩沖液(PBS緩沖液:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 IOmmoI/L，KH2PO4 2mmol/L，pH值為5?7)中，添加固體氫氧化鈉顆粒，使pH值達到11，然后在微波爐中加熱到70°C，加入多聚甲醛顆粒4g，快速搖動至溶解，用冰水浴對溶液進行冷卻，用濃硫酸調(diào)整pH值至7,最后添加30 μ I Tween20,配制好的組織固定液冷卻到 4。。；
[0063]固定流程為:將供試蟲體(室內(nèi)飼養(yǎng)棉鈴蟲3齡幼蟲，飼養(yǎng)室溫度27°C，相對濕度60%，光照16:8/L:D)直接投放入到4°C預(yù)冷的現(xiàn)配的固定液中，固定液的量與蟲體的體積比為20:1，用真空泵抽真空，保持負(fù)壓值-l.0kpa，時間15min，解除負(fù)壓后，確認(rèn)蟲體已沉入固定液底部，將固定液連同蟲體一起放入4°C保持12h ；
[0064]2、組織脫水
[0065]從固定液取出中組織固定完畢的蟲體，使用乙醇梯度溶液依次進行如下脫水步驟(乙醇溶液用量與蟲體的體積比為20:1):
[0066]I) 4°C條件下，50%乙醇中保持Ih,
[0067]2) 4°C條件下，60%乙醇中保持Ih,[0068]3) 4°C條件下，70%乙醇中保持Ih,
[0069]4) 4°C條件下，90%乙醇中保持Ih,
[0070]5)4°C條件下，無水乙醇中保持lh，
[0071]6)4°C條件下，無水乙醇中保持lh，
[0072]7) 4°C條件下，無水乙醇中保持Ih ；
[0073]3、組織透明處理
[0074]米用美國National Diagnotics 公司組織透明劑 Histo-Clear,每次 Histo-Clear的量與蟲體的體積比為20:1，依次進行以下3個步驟:
[0075]I)室溫條件下，Histo-Clear液體中浸泡1.5小時，
[0076]2)室溫條件下，Histo-Clear液體中浸泡1.5小時，
[0077]3)室溫條件下，Histo-Clear液體中浸泡2小時；
[0078]4、浸蠟與包埋
[0079]預(yù)先將石蠟在65°C下融化，將經(jīng)組織透明處理過的蟲體依次經(jīng)過以下4個浸蠟步驟:
[0080]I)浸入液體石蠟，65°C浸泡2h，
[0081]2)浸入液體石蠟，65°C浸泡2h，
[0082]3)浸入液體石蠟，65°C浸泡2h，
[0083]4)浸入液體石蠟，65°C浸泡2h，
[0084]將第四次的石蠟連同蟲體組織一起倒入包埋盒中，迅速調(diào)整蟲體在石蠟中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋；
[0085]5、切片
[0086]將蟲體石蠟包埋塊固定于切片機刀架上，蟲體橫切面垂直于刀口，修除近刀一端包埋塊的石蠟僅保留蟲體組織，控制切片厚度9 μ m進行連續(xù)切片；
[0087]6、展片
[0088]用毛筆將連續(xù)切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，用移液器滴加60°C蒸餾水150 μ I到切片邊緣，切片處于半懸浮狀態(tài)，待切片緩慢舒展；
[0089]7、粘片
[0090]展片置于35°C烘箱中，經(jīng)12h完成粘片；
[0091]8、脫蠟和組織復(fù)水
[0092]室溫條件下，對切片進行如下脫蠟和組織復(fù)水步驟:
[0093]I)用移液器將Histo-Clear液體輕滴加在切片組織上,保持20min,然后用吸水紙在切片邊緣吸走Histo-Clear,
[0094]2)用移液器將Histo-Clear液體輕滴加在切片組織上,保持20min,然后用吸水紙在切片邊緣吸走Histo-Clear,
[0095]3)用移液器將Histo-Clear液體輕滴加在切片組織上,保持20min,然后用吸水紙在切片邊緣吸走Histo-Clear,
[0096]4)用移液器將無水乙醇液體輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走無水乙醇，
[0097]5)用移液器將無水乙醇液體輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走無水乙醇，
[0098]6)用移液器將95%乙醇輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走95%乙醇，
[0099]7)用移液器將85%乙醇輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走85%乙醇，
[0100]8)用移液器將70%乙醇輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走70%乙醇，
[0101]9)用移液器將50%乙醇輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走50%乙醇，
[0102]10)用移液器將30%乙醇輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走30%乙醇，
[0103]11)用移液器將無菌水輕滴加在切片組織上，保持lmin，然后用吸水紙在切片邊緣吸走無菌水；
[0104]9、封片和觀察
[0105]在切片組織上滴加甘油I滴，蓋上蓋玻片，在可見光下觀察明場下的組織結(jié)構(gòu)，在藍光激發(fā)下觀察暗場下的特殊組織結(jié)構(gòu)(見圖1)。
[0106]在明場下觀察，發(fā)現(xiàn)體壁完整，體腔內(nèi)部的肌肉組織、神經(jīng)組織等分布其間，尤其是占身體比例非常大的消化道結(jié)構(gòu)清晰完整，甚至一對腹足也空間結(jié)構(gòu)正常(見圖1a);在藍光激發(fā)下，能夠觀察到各器官組織被激發(fā)的自發(fā)綠色熒光水平(見圖lb)。
【權(quán)利要求】
1.一種昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)組織固定: 取昆蟲蟲體浸于組織固定液中，抽真空并保持負(fù)壓10~30分鐘，再于4°C下靜置10~14小時； (2)組織脫水: 取組織固定后的蟲體，4°C條件下，依次用濃度梯度為50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間至少為I小時； (3)組織透明: 取組織脫水后的蟲體，室溫下在組織透明劑中浸泡5~9小時； (4)浸蠟、包埋與切片: 取組織透明后的蟲體，在65°C的液體石蠟中浸泡7~9小時，凝固定型后切片； (5)展片與粘片: 取切片移至載玻片上，在切片邊緣滴加60°C的蒸餾水至切片完全展開，再置于30~37°C條件下10~14小時粘片； (6)脫蠟和組織復(fù)水: 取組織透明劑滴加在切片組織上，保持至少20分鐘后吸走，重復(fù)至少3次，再依次滴加濃度梯度為100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每個梯度的處理時間為I~5分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(1)中的組織固定液為:取IOOmL PBS緩沖液，調(diào)節(jié)緩沖液pH值至10.5~11.5，加熱至65~75。。，加入多聚甲醛至終濃度為4%，待溶解完全后冷卻，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5~7.5，再加入30 μ L吐溫-20或吐溫X-100，冷卻至4°C備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述的的PBS緩沖液的組成為:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 IOmmoI/L，KH2PO4 2mmol/L，pH 值為5~7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(1)中負(fù)壓的壓力值為-l.0KPa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(2)中組織脫水步驟為: 1)4°C條件下，50%乙醇中保持lh， 2)4°C條件下，60%乙醇中保持lh， 3)4°C條件下，70%乙醇中保持lh， 4)4°C條件下，90%乙醇中保持lh， 5)4°C條件下，無水乙醇中保持lh， 6)4°C條件下，無水乙醇中保持lh， 7)4°C條件下，無水乙醇中保持lh。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(2)中乙醇用量與蟲體的體積比為20:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(3)中組織透明步驟為: 1)室溫條件下，組織透明劑中浸泡1.5~2小時； 2)室溫條件下，組織透明劑中浸泡1.5~2小時； 3)室溫條件下，組織透明劑中浸泡2~3小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述的組織透明劑為Histo—Clear。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(4)中浸蠟步驟為: 1)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時， 2)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時， 3)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時， 4)浸入液體石蠟，65°C浸泡2小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲幼蟲石蠟切片方法，其特征在于:所述步驟(6)中脫蠟和組織復(fù)水步驟為: 1)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走， 2)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走， 3)將組織透明劑滴加在切片組織上，保持20min后吸走，` 4)將無水乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 5)將無水乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 6)將95%乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 7)將85%乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 8)將70%乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 9)將50%乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 10)將30%乙醇滴加在切片組織上，保持Imin后吸走， 11)將無菌水滴加在切片組織上，保持Imin后吸走。
【文檔編號】G01N1/30GK103759994SQ201410001003
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】李永麗, 周洲, 源春彥, 李紅英, 劉圣明 申請人:河南科技大學(xué)