達質粒轉化肥K293T細胞，裂解 離屯、獲得上清，孤K親和層析柱純化，獲得純化的CD56重組蛋白；
[0039] 做單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的CD56重組蛋白免疫Ba化/c小鼠， 取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤 細胞，獲得能分泌抗CD56特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為Umab83,亞型鑒定為IgGl;通 過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得CD56單克隆抗體Um油83。分別通過 WesternBlot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。 陽040] 進一步采用化iGene高密度蛋白忍片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證： 化iGene高密度蛋白忍片上包含10, 000個肥K293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解 液在忍片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解 液的定位可W通過Excel文件進行準確定位。蛋白忍片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩 陣上有一些參照，通過參照，可W定量每個忍片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應數據的 重復性，W及定位陽性信號的方向。
[0041] 本發(fā)明將所述單克隆抗體Um油83與上述忍片雜交并確定陽性信號位點，結果顯 示本發(fā)明所述單克隆抗體Umab83特異性結合CD56蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。
[0042] 本發(fā)明還提供了單克隆抗體Um油83在制備用于檢測CD56蛋白的免疫檢測工具中 的應用。
[0043] 具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、忍片或試紙。
[0044] 在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗 體Umab83,可檢測組織細胞中CD56的表達狀況。
[0045] 本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。其中所 述腫瘤具體是指腫瘤細胞的增殖與CD56的表達密切相關的腫瘤，包括但不限于視網膜母 細胞瘤、髓母細胞瘤、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、小細胞癌、NK淋己瘤和自然殺傷細胞。 W46]與現有技術相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株（保藏編號為CGMCC No. 11081)，W及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體Umab83。本發(fā)明還提供了單克隆抗體 Umab83在制備用于檢測CD56蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體Umab83的免疫 組化試劑盒，W及單克隆抗體Um油83在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發(fā)明所述 單克隆抗體可與CD56蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了CD56 蛋白免疫檢測的特異性、準確性和可靠性，真實反映腫瘤細胞內CD56蛋白表達水平，可應 用于視網膜母細胞瘤、髓母細胞瘤、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、小細胞癌、NK淋己瘤和自然 殺傷細胞的輔助診斷與分型。
[0047]本發(fā)明提供了單克隆抗體及其用途、產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株、含有 該單克隆抗體的診斷工具中所用原料及試劑均可由市場購得。
[0048] 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明： W例實施例1、CD56重組表達質粒的構建
[0050] W從美國傲銳東源生物科技有限公司獲得的質粒RC207890 (含CD560RF2574bp) 為模板，設計兩條引物并分別引入酶切位點Sgfl和Mlul，克隆入表達載體pCMV6-Entry，建 立CD56重組表達質粒?？寺∥稽c設計如圖1所示。
[0051] 實施例2、CD56重組蛋白的表達與純化 陽05引1、轉染肥K293T細胞：肥K293T細胞W1:3傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取 7. 5mLDMEM(無血清及抗生素）至50mL管中，加入300yLPEIMegaTranl.O混勻；加入75yg CD56重組表達質粒DM至混勻液中，混勻并靜置30分鐘；分別取515μL至各培養(yǎng)皿中于 37°C5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染24小時后，每皿細胞添加25μL2M下酸鋼至終濃度5mM。
[0053] 2、裂解細胞：轉染48小時后，進行細胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入ImLPBS進行漂 洗，吸去PBS。加入ImL裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑PI和PMSF。置于冰盒中在 搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4°C離屯、，收集上清。取少量上清采用WB鑒定重 組CD56的表達，結果圖2。
[0054] 3、孤K親和層析柱純化：W 0. 45 μ M，33mm PVDF膜濾器過濾離屯、后的裂解液上清 并轉入15血管，加入混合好的Beads 1血，封口后放入360度混勻器中，于4°C結合2小時； 取出15mL管，將裂解液倒入BI0-RAD層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣WB檢測； W裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用TBST沖洗Beads 3次，滴盡后用0. 1M Glycine P冊.5洗脫，第一次200 μ以滴盡不收集，第二、Ξ次各500 μ以第立次250 μ以收集至一個 1.5血離屯、管中，并迅速加入NaH2P〇4(pH= 11.0)中和至抑7.0左右，每管加入甘油至終濃 度為10%，Tween-80至終濃度為0. 1%。純化后的重組CD56蛋白用SDS-PAGE鑒定，見圖 3。 陽化5] 由圖2結果可見，轉染pCMV6-rCD56質粒的肥K293T細胞裂解液中WB檢測后在 lOOkD處有明顯的特異條帶，與多膚的理論分子量80kD基本相符。表明細胞中重組CD56蛋 白特異表達。
[0056] 由圖3結果可見，純化的蛋白在PAGE膠lOOkD處有明顯的特異條帶，與多膚的理 論分子量80kD基本相符。表明已獲得了純度較好的CD56重組蛋白。
[0057] 實施例3、CD56單克隆抗體的制備與篩選
[0058] 根據標準方法用重組產生的純化的CD56蛋白片段用于對Ba化/c小鼠（北京維通 利華實驗動物技術有限公司）進行免疫。具體方法如下：
[0059] 1、動物免疫：經過純化的CD56抗原W完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方 法免疫6-8周齡Ba化/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進行第二次免疫，W不完 全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血W化ISA法梯度稀釋測定血清 效價；根據結果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。
[0060] 2、細胞融合：骨髓瘤細胞采用Ba化/c來源的sp2/0,融合時處于對數生長期；取 已免疫小鼠脾臟，制成淋己細胞單細胞懸液；小鼠脾淋己細胞與骨髓瘤細胞W1:5-1:10混 合，滴加37°C的50 %PEG(PH8. 0) 1血，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離屯、棄上清后加 入HAT培養(yǎng)基懸浮混勻，MC定容到50血，分裝到3. 5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37°C、 5%C〇2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0061] 3、篩選和克?。喝诤?-10天內挑選細胞克隆，使用CD56純化重組蛋白進行化ISA 測試。標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定化ISA值， 挑取0D280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至化ISA測定96孔板全板結果為陽 性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應融合板細胞株為Umab83。 陽06引4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性Ba化/c小鼠腹腔注射0. 5ml降植 燒，一周后每只小鼠用ImL注射器腹腔注射經PBS洗涂重懸的單克隆細胞懸液，細胞用量為 5Xl(yy只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離屯、取上清，親和層析法進 行腹水純化，根據抗體亞型選擇相應柱料，細胞株Um油83產生的單抗為IgGl，采用protein G進行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、WB檢測、分裝、凍存在-20°C。其中WB檢測結果見圖 4。
[0063] 由圖4結果可見，泳道2在分子量約lOOkD處有特異的條帶，表明單克隆抗體 Um油83能特異地Westernblot檢測完整的全長CD56蛋白。
[0064] 實施例4、單克隆抗體Um油83為一抗的免疫組化檢測 W6