一種檢測巴貝西蟲的方法及其專用試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測己貝西蟲的方法及其專用試劑盒，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 己貝西蟲病度油esiosis)臨床主要癥狀為高熱、溶血性貧血、黃痘和血紅蛋白 尿，是一種可經(jīng)媒介蠟叮咬、接觸動物（血液）、輸血W及母嬰傳播等獨特方式傳播的新發(fā) 人獸共患病。近幾年來，在世界各地人群感染病例不斷發(fā)生，甚至在美國幾個州爆發(fā)疫情， 在我國山東、浙江、新疆、云南及北京等地不斷發(fā)生己貝西蟲確診/疑似病例，已成為一種 "新的健康威脅"。目前全世界已相繼報道了寄生于脊椎動物體內(nèi)的己貝西蟲超過100種。 感染人的己貝西蟲主要包括微小己貝西蟲、鄧氏己貝西蟲、分歧己貝西蟲和獵戶己貝西蟲、 己貝西蟲KOl株等。由于該病存在相當比例的隱性或亞臨床感染者，臨床上極易誤診漏診。 臨床上目前主要利用血涂片、血清學檢查、補體結合試驗（CFT)甚至動物接種試驗來進行 確診。但由于形態(tài)學敏感性較低，血清學檢測不適合早期診斷，動物接種后需經(jīng)一定的潛伏 期即可在末梢血涂片中查到蟲體。受到很大限制。英光PCR方法由于其操作步驟簡單，反 應時間更短，整個過程可在化內(nèi)完成，結果判定簡單客觀，靈敏特異且能應用在自動化分 析系統(tǒng)中，故而適宜口診就診患者初查?；痲man探針帶有一個英光發(fā)光基團和一個英光渾 滅基團，完整的探針在特定光源激發(fā)下，發(fā)光基團所產(chǎn)生的英光被渾滅基團全部吸收，樣品 無英光。PCR過程中，Taq酶在延伸DNA鏈的同時，可通過自身的5' - 3'核酸外切酶活性 降解與模板結合的特異性英光探針，使英光報告基團與渾滅基團分離，分離后的英光報告 基團在特定光源激發(fā)下產(chǎn)生英光。通過監(jiān)測整個PCR過程英光信號的變化，對未知模板進 行定性分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測己貝西蟲的方法及其專用試劑盒，用本發(fā)明提供的 方法檢測己貝西蟲具有準確可靠、敏感性和特異性好的特點。
[0004] 本發(fā)明提供一組DNA分子，由如下（1) -0)所示的DNA分子組成：
[0005] (1)沈QIDNo. 2 所示的 DNA分子；
[0006] 似SEQIDNo. 3 所示的 DNA分子；
[0007] (3)SEQIDNo. 4 所示的 DNA分子。
[0008] -種檢測樣品中己貝西蟲含量的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒包含 如下（1)-(4)所示的分子：
[0009] (1)SEQIDNo. 2 所示的DNA分子；
[0010] 似沈QIDNo. 3所示的DNA分子；
[0011] 做SEQIDNo. 4所示的DNA分子，或5'端連接報告英光基團，3'端連接渾滅英光 基團的SEQIDNo. 4所示的DNA分子；
[001引 （4)沈QIDNo. 5所示的DNA分子；
[0013] 該試劑盒還包含使用說明書，說明書記載內(nèi)容如下：W不同濃度的含有SEQID No. 5所示DNA片段的重組質粒為模板，WSEQIDNo. 2所示的DNA分子和SEQIDNo. 3所示 的DNA分子為引物，W5'端連接報告英光基團，3'端連接渾滅英光基團的SEQIDNo. 4所 示的DNA分子為探針，進行實時英光定量PCR擴增，W每個反應中重組質粒的拷貝數(shù)為橫坐 標，對應的Ct值為縱坐標，制作標準曲線，得到標準曲線公式；提取待檢樣品的DNA，W其為 模板，按照上述方法，得到對應的Ct值，記作A;將A帶入標準曲線公式，得到重組質粒的拷 貝數(shù)，即為待檢樣品中的己貝西蟲含量；
[0014] 所述SEQIDNo. 5所示的DNA分子是位于重組質粒上的，所述重組質粒為將SEQID No. 5所述的DNA分子插入pMD18-T得到。
[0015] 上述試劑盒中，所述己貝西蟲為雙芽己貝西蟲化bigemina)、獵戶己貝西蟲 度.venatorum)、分歧己貝西蟲化divergens)和/或鹿己貝西蟲度.capreoli)。
[0016] 一種檢測樣品中己貝西蟲含量的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，包括如下步驟： W不同濃度的含有沈QIDNo. 5所示DNA片段的重組質粒為模板，WSEQIDNo. 2所示的DNA 分子和SEQIDNo. 3所示的DNA分子為引物，W5'端連接報告英光基團，3'端連接渾滅英 光基團的SEQIDNo. 4所示的DNA分子為探針，進行實時英光定量PCR擴增，W每個反應中 重組質粒的拷貝數(shù)為橫坐標，對應的Ct值為縱坐標，制作標準曲線，得到標準曲線公式；提 取待檢樣品的DNA，W其為模板，按照上述方法，得到對應的Ct值，記作A;將A帶入標準曲 線公式，得到重組質粒的拷貝數(shù)，即為待檢樣品中的己貝西蟲含量；
[0017] 所述SEQIDNo. 3所示的DNA分子為四種引物的等濃度混合物；
[0018] 所述報告英光基團具體為FAM，所述渾滅英光基團具體為TAMRA。
[0019] 上述方法中，所述重組質粒為將SEQIDNo. 5所述的DNA分子插入PMD18-T得到。
[0020] 上述任一所述的方法中，所述實時英光定量PCR的反應體系如下；2XPremixEx I'aqlOul、濃度為IOuM的沈QIDNo. 2所示的DNA分子0. 8ul、濃度為IOuM的沈QIDNo. 3 所示的DNA分子0. 8ul、濃度為IOuM的5'端連接報告英光基團，3'端連接渾滅英光基團的 SEQIDNo. 4 所示的DNA分子 0. 4ul、模板 2. 5UL、(1地2〇5. 5
[0021] 所述實時英光定量PCR的反應程序如下；95°CIOmin;95°C15s，6(TC30s，45個循 環(huán)；50°C5min;
[0022] 所述2XPremixExTaq購自寶生物工程（大連）有限公司，貨號為DRR039A。
[0023] 上述任一所述的方法中，所述標準曲線的制作過程中所述模板的濃度為 4. 4-4. 4X1〇4 拷貝數(shù) / 微升，具體為 4. 4、44、4. 4X102、4. 4X103、4. 4X1〇4 拷貝數(shù) / 微升。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述己貝西蟲為雙芽己貝西蟲化bigemina)、獵戶己貝 西蟲度.venatorum)、分歧己貝西蟲化divergens)和/或鹿己貝西蟲度.capreoli)。
[00巧]上述DNA分子或上述任一所述的試劑盒在制備檢測己貝西蟲的產(chǎn)品中的應用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 上述應用中，所述己貝西蟲為雙芽己貝西蟲化bigemina)、獵戶己貝西蟲 度.venatorum)、分歧己貝西蟲化divergens)和/或鹿己貝西蟲度.capreoli)。
[0027] 本發(fā)明提供的方法中探針引物針對常見己貝西蟲18SrRNA高變區(qū)和保守區(qū)進行 設計，在最大地保留檢測敏感性的前提下，盡量減少其他近緣物種的交叉反應性，提高了檢 測的特異性。本發(fā)明利用實時英光定量PCR-化qMan探針法對己貝西蟲進行定量檢測，較之 當前臨床上采用的形態(tài)學、免疫英光法，可大大提高檢測的靈敏度，具有快速、簡便的特點， 適合基層醫(yī)院W及該病的傳播媒介、動物宿主監(jiān)測使用。
【附圖說明】
[0028] 圖1為普通PCR擴增驗證。
[0029] 圖2為采用ABI7500儀器檢測的，W10倍梯度稀釋的質粒地油esill6為模板的 實時英光定量PCR擴增曲線和標準曲線。
[0030] 圖3為采用羅氏Li曲tcycle2. 0儀器檢測的，W10倍梯度稀釋的質粒地油esill6 為模板的實時英光定量PCR擴增曲線和結果。
[003。 圖4為實時英光定量PCR擴增得到的片斷的比對結果。
[0032] 圖5為引物和探針的可靠性檢測。
[003引圖6為實時英光定量PCR擴增陽性患者的片段的測序結果。
[0034] 圖7為引物和探針的特異性檢測。
[0035] 圖8為引物和探針的參數(shù)。
[0036] 圖9為上游引物、優(yōu)化前下游引物和探針的敏感性和特異性。
[0037] 圖10為上游引物在己貝西蟲、近緣種W及喃齒動物和人源18srRNA對應位置序列 的比對結果。
[003引圖11為優(yōu)化前下游引物在己貝西蟲、近緣種W及喃齒動物和人源18srRNA對應位 置序列的比對結果。
[0039] 圖12為探針在己貝西蟲、近緣種W及喃齒動物和人源18srRNA對應位置序列的比 對結果。
【具體實施方式】
[0040] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 2XPremixExTaq購自寶生物工程（大連）有限公司，貨號為DRR039A。
[0043] 嚴重聯(lián)合免疫缺陷（severecombinedimmunedeficien巧,SCID)小鼠購自軍事醫(yī) 學科學院實驗動物中必。
[0044] 人紅細胞購自軍事醫(yī)學科學院附屬307醫(yī)院。
[0045] PMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。
[0046] 實施例1、引物和探針的設計
[0047] -、己貝西蟲的ISsrRNA基因存在H個主要的高變區(qū)，第一個位于自5'末端起第 100-200nt的位置，第二個位于550-66化t的位置，第H個位于1250-13(K)nt的位置。己貝 西蟲不同種之間的差異在化0% -11. 2%之間，與喃齒動物W及人源的18srRNA基因對應位 置相差均接近30%。
[004引根據(jù)引物設計原則，將包含己貝西蟲的18srRNA基因第二高變區(qū)（自5'末端起 第550-660位核巧酸）的一段406bp基因區(qū)域（SEQIDNo. 1)(該序列來源于分歧己貝西蟲 度油esiadivergens),GenBank中序列登記號GU05738