用于制備糖和糖漿的方法
【專利說明】用于制備糖和糖漿的方法
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包括一個計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生糖和糖漿（特別是高果糖玉米糖漿（HFCS))的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 已經(jīng)描述了大量用于將淀粉轉(zhuǎn)化為淀粉水解物（例如麥芽糖、葡萄糖或特制糖 漿）的方法，這些淀粉水解物用作甜味劑或者用作其他糖（例如果糖）的前體。還可以將 葡萄糖發(fā)酵為乙醇或其他發(fā)酵產(chǎn)品。
[0006] 淀粉是一種由葡萄糖單位鏈組成的高分子量聚合物。它通常由約80%支鏈淀粉和 20%直鏈淀粉組成。支鏈淀粉是一種分支多糖，其中α -1，4D-葡萄糖殘基的直鏈由α -1，6 糖苷鍵連接。
[0007] 直鏈淀粉是一種由D-吡喃葡萄糖單位構(gòu)成的線性多糖，這些單位通過α -1，4糖 苷鍵連接在一起。在將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性淀粉水解物的情況下，將淀粉解聚。常規(guī)的解聚 方法由一個糊化步驟和兩個連續(xù)的工藝步驟（即液化過程和糖化過程）組成。顆粒狀淀粉 由在室溫下不溶于水的微觀顆粒組成。加熱一種水性淀粉漿液時，顆粒膨脹并且最后破裂， 將淀粉分子分散至溶液中。在此"糊化"過程中，粘度有顯著的增加。由于典型工業(yè)方法中 的固體水平為30% -40%，因此不得不稀釋或"液化"淀粉以使其能夠被操作。如今主要是 通過酶降解而獲得粘度的降低。
[0008] HFCS制造自高DX糖漿，術(shù)語DX意指按根據(jù)糖漿的干物質(zhì)（DS)計算的右旋糖 (D-葡萄糖）的重量計的百分比。通常用于將淀粉轉(zhuǎn)化為高DX糖漿的整體酶工藝是一個兩 階段過程。第一步是液化，其中長鏈淀粉被α-淀粉酶降解為較小的分支單位和線性單位 (麥芽糊精）。液化過程典型地是在約105°C -IKTC下進行約5至10分鐘，隨后在約95°C 下進行約1-2小時。然后將溫度降至60°C，添加葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任選地脫支酶 (例如異淀粉酶或普魯蘭酶），并且將糖化過程進行約24至72小時。
[0009] WO 2013/057141和WO 2013/057143描述了 α -淀粉酶變體及其在例如淀粉加工、 發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生、用于由包含未糊化淀粉的材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法以及用于由包含糊化淀 粉的材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法中的用途。這些變體被描述為當(dāng)在低PH下和/或高溫下，特 別是在低鈣濃度下，并且特別是在至少〇. 1%淀粉的存在下（例如，在〇. 9%或1%淀粉的存 在下）孵育時具有例如增加的穩(wěn)定性。
[0010] 仍需要對用于產(chǎn)生糖和糖漿的方法進行改進。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 在一方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生糖漿的方法：
[0013] a)用α -淀粉酶變體液化水性顆粒狀淀粉漿液，該變體在對應(yīng)于SEQ ID NO: 1的 以下任何位置的一個或多個位置處包括改變：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、 185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450,以提供包含液化淀粉的材料；
[0014] b)在葡糖淀粉酶和來源于脫支芽孢桿菌（Bacillus deramificans)、枯草芽孢桿 菌、淀粉脫支芽孢桿菌（Bacillus amyloderamificans)或嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌的普魯蘭 酶的存在下糖化該包含液化淀粉的材料，以提供右旋糖糖漿，并且任選地
[0015] c)進行異構(gòu)化以提供果糖糖漿。
[0016] 在一些方面，α -淀粉酶變體、葡糖淀粉酶和來源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶的組 合對觀察的最終糖漿產(chǎn)生增強效果，特別是與沒有組合酶情況下獲得的DX百分比相比，DX 有所增加。
[0017] 附圖簡要說明
[0018] 圖1示出具有以下氨基酸序列的α -淀粉酶的比對：
[0019] SEQ ID NO: 1是地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0020] SEQ ID NO: 2是嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0021] SEQ ID Ν0:3 是在應(yīng)用微生物學(xué)雜志（J. Appl. Microbiology)，1997， 82:325-334 (SWALL:q59222)中描述的芽孢桿菌屬α-淀粉酶TS-23。
[0022] SEQ ID Ν0:4是在TO 2005/001064中描述的黃熱芽孢桿菌（Bacillus flavothermus) α -淀粉酶 AMY1048。
[0023] SEQ ID NO: 5是在TO 04/113511中描述為SEQ ID NO: 21的芽孢桿菌屬α-淀粉 酶 TS-22〇
[0024] SEQ ID NO:6是解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0025] SEQ ID NO: 7是在WO 95/26397中描述為SEQ ID NO 1的芽孢桿菌堿性屬SP690 淀粉酶。
[0026] SEQ ID NO:8是在TO 95/26397 中描述為 SEQ ID NO 2 的鹽敏芽孢桿菌（Bacillus halmapalus) α -淀粉酶。
[0027] SEQ ID NO:9是在WO 00/60060中描述為SEQ ID NO 4的芽孢桿菌堿性屬ΑΑ560 淀粉酶。
[0028] SEQ ID NO: 10是在WO 200210356中描述為SEQ ID NO 2的芽孢桿菌堿性屬A 7-7 淀粉酶。
[0029] SEQ ID NO: 11是在冢本（Tsukamoto)等人（1988,生物化學(xué)與生物物理研究通訊 (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 151:25-33)中描述的芽抱桿菌喊性屬 SP707 淀粉酶。
[0030] SEQ ID NO: 12是在EP 1022334中描述為SEQ ID NO 2的芽孢桿菌堿性屬K-38淀 粉酶。
[0031] SEQ ID NO: 13 是在李（Lee)等人，2006，生物化學(xué)雜志（J. Biochem)， 139:997-1005中描述的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。
[0032] SEQ ID NO: 14是以前在例如WO 2002/010355中披露的變體α -淀粉酶LE399。
[0033] 發(fā)明詳細說明
[0034] 定義
[0035] 術(shù)語"顆粒狀淀粉"被理解為生的未煮過的淀粉，即尚未經(jīng)歷糊化的淀粉。淀粉是 在植物體內(nèi)作為不溶于水的微小顆粒而形成。這些顆粒在低于初始糊化溫度的溫度下被保 存為淀粉。當(dāng)放入冷水中時，這些顆?？梢晕丈倭康囊后w。高達50°C至70°C，膨脹是可 逆的，可逆性程度取決于具體的淀粉。在更高溫度下，開始不可逆膨脹，稱為"糊化"。
[0036] 術(shù)語"特制糖漿"是本領(lǐng)域公認的術(shù)語并且根據(jù)"右旋糖當(dāng)量"（DE)和碳水化 合物譜進行表征（參見由G. G.伯奇（G. G. Birch)和L. F.格林（L. F. Green)編輯的教科 書"食品碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)與功能（Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate)"中的第50+頁的文章"新特制葡萄糖糖衆(zhòng)（New Speciality Glucose Syrups)"，應(yīng)用科學(xué)出版社有限公司（Applied Science Publishers LTD.)，倫敦）。典型 地，特制糖漿的DE范圍是從35至45。
[0037] α -淀粉酶：α -淀粉酶（E. C. 3. 2. I. 1)是催化淀粉以及其他線性和分支1，4糖苷 寡糖和多糖的水解的一組酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何確定α-淀粉酶活性。它可根據(jù) 在實例中描述的程序例如通過PNP-G7測定來確定。在一方面，本發(fā)明的變體具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α -淀粉酶活性的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方面，本申請的變體具有其 親本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%或至少100%。
[0038] 葡糖淀粉酶：葡糖淀粉酶是催化D-葡萄糖從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還 原端釋放的l，4-a_D-葡聚糖葡糖水解酶（EC 3.2. 1.3)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)下文的 "材料與方法"部分所述的程序來確定葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶單位（AGU)定義為 在以下標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量：37°C，pH 4. 3,底物：麥芽糖23. 2mM， 緩沖液：乙酸鹽0. 1M，反應(yīng)時間5分鐘。
[0039] 片段：術(shù)語"片段"意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個（例 如，若干個）氨基酸的多肽；其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一個片段含有至 少300個氨基酸殘基、至少350個氨基酸殘基、至少400個氨基酸殘基、至少450個氨基酸 殘基、至少470個氨基酸殘基或至少480個氨基酸殘基。
[0040] 分離的：術(shù)語"分離的"意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的 物質(zhì)的非限制性實例包括（1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)上相關(guān)的一種或多種或 所有天然存在的成分中去除；（3)相對于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或（4) 通過增加該物質(zhì)相對于與其本質(zhì)相關(guān)的其他組分的量而修飾的任何物質(zhì)（例如，編碼該物 質(zhì)的基因的多拷貝；使用比編碼該物質(zhì)的基因本質(zhì)上相關(guān)的啟動子強的啟動子）。一種分 離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0041] 成熟多肽：術(shù)語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。本領(lǐng)域已知宿主細胞可以 產(chǎn)生由相同的多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽（即，具有不同的C-末端和/或 N-末端氨基酸）的混合物。成熟形式的一些α -淀粉酶（例如，一些細菌α -淀粉酶）包 括含有用于底物水解的活性位點的催化結(jié)構(gòu)域以及用于結(jié)合碳水化合物底物（淀粉）的一 個或多個碳水化合物結(jié)合模塊（CBM)以及任選地將一個或多個CBM與催化結(jié)構(gòu)域連接的多 肽，后一類型的區(qū)域通常稱為"接頭"。
[0042] 親本或親本α-淀粉酶：術(shù)語"親本"或"親本α-淀粉酶"意指進行變化以產(chǎn)生 本發(fā)明的酶變體的α-淀粉酶。親本可以是天然存在的（野生型）多肽或其變體或片段。
[0043] 普魯蘭酶：普魯蘭酶（EC 3.2. 1.41)水解普魯蘭（α-1,6-連接的麥芽三糖單 位的線性聚合物）中和支鏈淀粉和糖原以及支鏈淀粉和糖原的α-和β-極限糊精中 的a-l，6_D-糖苷鍵。普魯蘭酶（pullulanase)的一個或多個其他名稱是例如淀粉普魯 蘭酶（amylopullulanase)，支鏈淀粉6-葡聚糖水解酶；細菌脫支酶；脫支酶；α -糊精內(nèi) 切-1，6-α -葡糖苷酶；R-酶。系統(tǒng)名稱是"普魯蘭α -1，6-葡聚糖水解酶"。屬于此類別 的酶可以包括碳水化合物結(jié)合模塊（CBM)。
[0044] 碳水化合物結(jié)合模塊：碳水化合物結(jié)合模塊或碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠通 常以非共價結(jié)合而結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合多糖 (例如纖維素、木聚糖或淀粉）的結(jié)構(gòu)域。若干碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被描述于文獻 中，并且已經(jīng)被分組為多個家族，綜述參見布拉司頓（Boraston)等人（2004)生物化學(xué)雜志 (Biochem. J.) 382:769-781 和 http: //afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/index. html 中對 CBM 家族 的分組。"淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域"是對淀粉（特別是生淀粉）具有特異性的碳水化合物結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少被發(fā)現(xiàn)于碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族CBM-20、CBM-21、CBM-25、 CBM-26、CBM-34、CBM-41 以及 CBM-45 中。
[0045] 序列一致性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)"序 列一致性"來描述。
[0046] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人， 2000,遺傳學(xué)趨勢（Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本）的尼德爾 (Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德爾 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物學(xué)雜志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)來確定兩個氨 基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位延伸罰分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出 (使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0047] (一致的殘基XIOOV (比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0048] 變體：術(shù)語"變體"意指在一個或多個（例如，若干個）位置處包括改變（即，取代、 插入和/或缺失）的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用一個不同氨基酸置換占用一 個位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指鄰近于占據(jù)一個位 置的氨基酸添加一個或多個（例如，若干個）氨基酸（例如，1-5個氨基酸）。在一方面，本 發(fā)明的變體具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方 面，本申請的變體具有其親本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %。α -淀粉酶活性可通過 在實例中描述的PNP-G7測定來確定。
[0049] 野生型α -淀粉酶：術(shù)語"野生型" α -淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然 界中發(fā)現(xiàn)的細菌、酵母或絲狀真菌來表達的α-淀粉酶。
[0050] 變體命名慣例：出于本發(fā)明的目的，將SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽用來確定另 一種α-淀粉酶中的對應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種α-淀粉酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1 中披露的成熟多肽進行比對，并且基于該比對，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物 學(xué)開放軟件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice) 等人，2000,遺傳學(xué)趨勢（Trends Genet. ) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0.0版或更新版本）的尼德 爾（Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman (尼德 爾曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物學(xué)雜志（J. Mol. Biol. )48:443-453)來確定對應(yīng) 于SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基的氨基酸位置編號。所使用的參數(shù) 是空位開放罰分10,空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 陣。
[0051] 可以通過使用若干計算機程序，使用其對應(yīng)默認參數(shù)比對多個多肽序列來確定在 另一種α -淀粉酶中的對應(yīng)氨基酸殘基的鑒定，所述計算機程序包括但不限于MUSCLE (通 過對數(shù)預(yù)期的多種序列比較；版本3. 5或更新版本；埃德加（Edgar)，2004，核酸研究 (Nucleic Acids Research) 32:1792-I797)、MAFFT (版本 6· 857 或更新版本；加藤（Katoh) 和庫馬（Kuma)，2002,核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005,核酸研究33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,生物信息學(xué)（Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人，2009,分子 生物學(xué)方法（Methods in Molecular Biology)537:39-64;加藤和都，2010,生物信息學(xué) 26:1899-1900)以及采用Clustaiwa 83或更新版本；湯姆斯（Thompson)等人，1994,核酸 研究 22:4673-4680)的 EMBOSS EMMA。
[0052] 當(dāng)其他酶與SEQ ID N0:1的成熟多肽相背離使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法 不能檢測其相互關(guān)系時（林達爾（Lindahl)和埃洛弗松（Elofsson)，2000,分子生物學(xué) 雜志（J. Mol. Biol.) 295:613-615)，可應(yīng)用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索 中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示（譜 (profile))來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，PSI-BLAST程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個 譜，并且能夠檢測遠距離同源物（阿特休爾（Atschul)等人，1997,核酸研究（Nucleic Acids Res. )25:33