mir-612-R :5, CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'（沈Q ID N0:2)
[0041] U6特異性引物：
[0042] U6-F :5, GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'（SEQ ID N0:3)
[0043] U6-R :5, CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'（沈Q ID N0:4)
[0044] 2)hsa-mi;r-612聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液的配制 W45] 將各成分（引物和Premix)按一定比例混合在一起。單個反應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 液包括？的111；[又10111^，113日-111；[1-612-尸（10111)0.5 111^，113日-111；[1-612-尺（10111)0.5 111^，最后 用無菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至18. 0yL。
[0046] 3) U6聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液的配制
[0047] 將各成分（引物和Premix)按一定比例混合在一起。單個反應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 液包括Premix10yL濃度為10yM的U6-F0. 5yL濃度為10yM的U6-R0. 5yL最后用 無菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至18. 0yL。 W4引 4)檢測反應(yīng)
[0049]取hsa-mir-612聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液18. 0 y L加入2. 0 y L待檢模板。取U6聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液IS.OiiL加入2.0yL待檢模板。每批次反應(yīng)均設(shè)置陰性質(zhì)控化2〇)和陽性質(zhì) 控（體外合成的hsa-mir-612基因）。采用CFX-96巧光定量PCR儀。反應(yīng)條件如下：
陽化0]
[0051]
[0052] 5)結(jié)果判斷
[0053] qPCR反應(yīng)結(jié)束后，實驗人員可W通過使用儀器的控制軟件界面查看各基因的擴(kuò)增 狀況。在一般情況下，一個良好的qPCR實驗，其內(nèi)參基因U6的表達(dá)量相對都比較高，反映 到擴(kuò)增曲線上，其擴(kuò)增曲線呈"S"型，并且Ct或Cp值約為20或20W下。同時實驗人員也 可W通過軟件界面查看各基因的融解曲線情況，來判斷其是否為特異性擴(kuò)增，理論上，如融 解分析曲線呈"單峰"狀態(tài)，即為特異性擴(kuò)增。
[0054] 如果檢測通道沒有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，判為hsa-mir-612基因陰性；如果檢測通道 出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，且Ct值> 35. 0,判為hsa-mir-612基因陰性；如果檢測通道出現(xiàn)S型 擴(kuò)增曲線，且Ct值《35. 0,判為hsa-mi;r-612基因陽性。 陽05引 實施例2 :
[0056] 檢測食管癌中hsa-hsa-mi;r-612試劑盒的靈敏度評價
[0057] 通過紫外分光光度法測定hsa-mi;r-612基因（體外合成，序列來源于miRBase， Accession:MI0003625/MIMAT0003280)濃度（copies/mL)，然后對其進(jìn)行 10 倍梯度稀 釋，稀釋后的濃度分別為 2000000copies/test、200000copies/test、20000copies/test、 2000copies/test、200copies/test、20copies/test、2copies/test，及NTC，然后利用本發(fā) 明所述試劑盒進(jìn)行檢測，從圖1可W看出，所述試劑盒的最低檢測限《20copies/mL。
[0058]然后將濃度2000copies/test、200copies/test、20copies/test及NTC分別重復(fù) 5次，結(jié)果如圖2所示。
[0059] 由此可見，本發(fā)明所述試劑盒性能完全與文中相關(guān)描述吻合，可W特異、敏感地檢 測Jhsa-hsa-mi;r-612 基因。
[0060] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤飾，運些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 食管癌中hsa-mir-612的檢測引物組，其特征在于，包括hsa-mir-612基因特異性引 物組、內(nèi)參U6基因特異性引物組； 所述hsa-mir-612基因特異性引物組包括： 上游引物hsa-mir-612-F，如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列， 下游引物118&11化-612-1?，如3￡〇10勵:2所示的核苷酸序列 ； 所述內(nèi)參U6基因特異性引物組包括： 上游引物U6-F，如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列， 下游引物U6-R，如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測hsa-mir-612的檢測引物組，其特征在于，所述SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4具有至多5個核苷酸差異的序列。3. 如權(quán)利要求2所述的檢測hsa-mir-612的檢測引物組，其特征在于，對所述 hsa-mir-612基因特異性引物組、內(nèi)參U6基因特異性引物組進(jìn)行硫化、甲基化、形成肽核 酸、在核糖的2'位置引入甲基和/或氟取代基。4. 檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1-3任意一所述的 檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的引物組。5. 如權(quán)利要求4所述的檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的試劑盒，其特征在于，還包括陰性 質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品為H 20,所述陽性質(zhì)控品為體外合成的hsa-mir-612 基因。6. 如權(quán)利要求4所述的檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的試劑盒，其特征在于，還包括 Premix，所述Premix包含DNA聚合酶、SYBR Green I、dNTPs及PCR反應(yīng)緩沖液。7. 如權(quán)利要求6所述的檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 分為陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、hsa-mir-612反應(yīng)體系、內(nèi)參U6反應(yīng)體系； 所述hsa-mir-612反應(yīng)體系包括Premix IOy L，濃度為IOyM的 hsa-mir-612-FO. 5 y L，濃度為10 y M的hsa-mir-612-R 0. 5 y L，最后用無菌超純水將反應(yīng) 體系補(bǔ)至18. OyL ; 所述內(nèi)參U6反應(yīng)體系包括Premix IOy L，濃度為IOy M的U6-F 0.5 yL，濃度為IOy M 的U6-R 0. 5 y L，最后用無菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至18. 0 y L。8. 權(quán)利要求4-7任意一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 提取樣本的核酸DNA ; 2) 取待檢樣本進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值，判斷樣品屬性。9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟2)中熒光定量PCR擴(kuò)增 反應(yīng)的程序為 95°C，IOmin ;95°C，15sec ;60°C，Imin0
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人類hsa-mir-612基因擴(kuò)增的檢測引物組及試劑盒。檢測hsa-mir-612基因擴(kuò)增的引物組，包括hsa-mir-612基因特異性引物組、內(nèi)參U6基因特異性引物組。所述試劑盒包括hsa-mir-612基因特異性引物組、內(nèi)參U6基因特異性引物組、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、Premix。本發(fā)明通過設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，實現(xiàn)各個成分在反應(yīng)體系內(nèi)的最佳濃度配比，最大程度的實現(xiàn)了熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的高靈敏性，高特異性等特點，操作簡捷，單個反應(yīng)從樣品處理只需1.5-2小時，適合大規(guī)模樣本的處理，同時結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105154537
【申請?zhí)枴緾N201510521105
【發(fā)明人】孫艷玲, 郝武會, 李彥格
【申請人】北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年8月24日