一種不育系快速轉(zhuǎn)育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速的不育系轉(zhuǎn)育方法，通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù)和分子標(biāo)記選擇技 術(shù)相結(jié)合的方法快速轉(zhuǎn)育不育系，屬于作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用雄性不育系制種，可以省去人工去雄這一環(huán)節(jié)，既節(jié)省勞力，又能提高制種質(zhì) 量，降低種子生產(chǎn)成本，還具有較強(qiáng)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)功能。雄性不育性受細(xì)胞質(zhì)控制，轉(zhuǎn)育 容易。目前，在生產(chǎn)上應(yīng)用的雄性不育系大多都是經(jīng)人工轉(zhuǎn)育獲得。傳統(tǒng)的不育系轉(zhuǎn)育方 法是回交轉(zhuǎn)育法，此法簡(jiǎn)單，易操作。通過(guò)已有的雄性不育系(非輪回親本)和需轉(zhuǎn)育成不育 系的材料(輪回親本）雜交和連續(xù)回交5 - 7代，每代定向選擇與輪回親本性狀一致的不育 系，一般至少需3-4年才能獲的與輪回親本一樣的穩(wěn)定不育系。傳統(tǒng)的不育系轉(zhuǎn)育方法和 技術(shù)存在的問(wèn)題：1、周期長(zhǎng)。如果一年兩季，也至少需3-4年。2、成本高。雜交一次，回交 5 - 7代，每代定向選擇，需較大的人力、物力。近年來(lái)，也報(bào)道了許多快速獲得雄性不育系 的方法，如利用分子標(biāo)記輔助選擇回交后代，也大大減少回交代數(shù)和種植樣本數(shù)，節(jié)省了勞 力和成本，但也至少需2-3年。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種快速的不育系轉(zhuǎn)育方法，通過(guò)體細(xì)胞雜交 技術(shù)和分子標(biāo)記選擇技術(shù)相結(jié)合的方法快速轉(zhuǎn)育不育，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種不育系快速轉(zhuǎn)育方法，材料選擇、酶解和離心，得到原 生質(zhì)體和胞質(zhì)分離；然后通過(guò)對(duì)供、受體的有效鈍化、融合，獲得胞質(zhì)融合體；融合體的培 養(yǎng)和再生，最后，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記選擇獲得不育系再生植株。
[0005] -種不育系快速轉(zhuǎn)育方法，包含以下步驟： (1) 供受體的原生質(zhì)體的分離 1) 材料：培養(yǎng)50-80天的煙草無(wú)菌苗； 2) 酶解：1%纖維素酶+0. 5%果膠酶+0. 6mol/L甘露醇+0. 1%MES的酶液組合，在 25-28°C下酶解，離心； 3) 胞質(zhì)體：0. 6mol/L甘露醇+15%、30%、45%蔗糖梯度，離心獲得胞質(zhì)體； (2) 非對(duì)稱融合技術(shù) 1) 鈍化：〇. ImM I0A處理受體后離心； 2) 化學(xué)融合：在25~30 °C下，40%的PEG融合20~25min ; 3) 電融合：以 _=:1]'~1.5V; tl:40s ;|g|Un 5〇￥鄺2:5〇0 8;112和_|1]"~1.5￥; t3:40s的參數(shù)融合； (3) 融合體的培養(yǎng)和再生 1)融合體的培養(yǎng)：以DH)培養(yǎng)基培養(yǎng)，50%以上融合體開(kāi)始分裂后加入新鮮培養(yǎng)基 KM8P，此后每周加入滲透壓減半的新鮮培養(yǎng)基KM8P ; 2)愈傷的增值和分化：增值培養(yǎng)基：l/2MS+2. 5 mg/L IBA+ 1. 5 mg/L KT，分化培養(yǎng)基： MS+O. 25 mg/L IAA+2. 0 mg/L KT ； (4)不育系的鑒定篩選 1) 基因型：SSR、ISSR分子標(biāo)記鑒定； 2) 表現(xiàn)型：與受體表現(xiàn)性狀一致，但不育，能接受受體和其他煙草材料的花粉而結(jié)實(shí)； 3) 倍性：氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法。
[0006] 本發(fā)明的有益效果：1、周期較短，1年左右即可獲得轉(zhuǎn)育的不育系，縮短轉(zhuǎn)育時(shí) 間；2、不需要大量的人力及土地，節(jié)工省本；3、雄性不育系植株的生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花結(jié)實(shí)性狀 以及配合力都正常；4、雄性不育性穩(wěn)定，不育株率和不育度均能達(dá)到100%。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為本發(fā)明的操作流程圖； 圖2酶解時(shí)間、離心速度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)質(zhì)量的影響； 圖3原生質(zhì)體融合過(guò)程（聚乙二醇法）；圖中1:剛游離出來(lái)的葉肉原生質(zhì)體；2:在 PEG的作用下，葉肉原生質(zhì)體剛發(fā)生粘連；3 :在高Ca++/高pH作用下原生質(zhì)體開(kāi)始融合；4 : 用CPW-10. 5M洗滌原生質(zhì)體繼續(xù)融合；5 :洗滌后兩個(gè)原生質(zhì)體最終融合成為一個(gè)細(xì)胞； 圖4融合體的再生與鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 1)高產(chǎn)、高活力原生質(zhì)體制備技術(shù) 原生質(zhì)體制備就是植物細(xì)胞脫去細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體，它是原生質(zhì)培養(yǎng)的第一步，同 時(shí)也是非常關(guān)鍵的一環(huán)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力直接影響著原生質(zhì)體細(xì)胞培養(yǎng)的成功與 否。就影響原生質(zhì)體分離時(shí)的產(chǎn)量與活力來(lái)說(shuō)，主要應(yīng)考慮如下因素：植物基因型，制取原 生質(zhì)體的材料，酶的種類及其組合，酶液的滲透壓，原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑，酶解時(shí)間與溫度，分 離與純化的方法，離心轉(zhuǎn)速以及時(shí)間等。 a、酶解液對(duì)煙草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響 采用目前常用的纖維素酶Cellulase R-10、果膠酶Pectinase Y-23和離析酶 Macer-ozyme R-10，設(shè)置不同濃度組合探討酶液對(duì)煙草葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量和活 力的影響。
[0009] b、酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的影響： 從酶解后2h開(kāi)始，每隔2h在倒置顯微鏡下觀察原生質(zhì)體酶解情況并計(jì)數(shù)。獲得最佳 酶解時(shí)間。
[0010] C、離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的影響 酶液組合和酶解時(shí)間取如上實(shí)驗(yàn)中最佳值，設(shè)置離心轉(zhuǎn)速分別為300r/min、500/min、 700/min、1000/min四個(gè)轉(zhuǎn)速，分別離心3min和5min。探討離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的影響對(duì) 原生質(zhì)體產(chǎn)率和活力的影響。
[0011] d、滲透壓穩(wěn)定劑濃度影響 選擇如上最佳酶組合，酶解時(shí)間，離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，酶解液中甘露醇的濃度分別為 0.4mol/L、0.5mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L (洗滌液中使用同樣濃度的甘露醇 溶液）制備原生質(zhì)體，觀察原生質(zhì)體的產(chǎn)率和活率情況，選擇最適滲透壓穩(wěn)定劑濃度。
[0012] e、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 依據(jù)上述試驗(yàn)所獲得的最佳條件，設(shè)15 °C、20°C、25°C、30°C、35°C 5個(gè)溫度處理.比 較在不同溫度條件下葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量，獲得最佳酶解溫度。
[0013] 通過(guò)以上各影響因素的優(yōu)化，獲得制備高活力、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體制備技術(shù)體系。
[0014] 2)設(shè)置與原生質(zhì)體等滲的蔗糖梯度密度，不同的超速離心轉(zhuǎn)速與離心時(shí)間，探索 獲得高純度、高活力的供體胞質(zhì)體的分離方法。
[0015] 3)胞質(zhì)-原生質(zhì)體非對(duì)稱融合技術(shù)的優(yōu)化： a.碘乙酰胺鈍化受體原生質(zhì)體 設(shè)置不同的碘乙酰胺（I0A)濃度和處理方法處理原生質(zhì)體，探索煙草原生質(zhì)體鈍化的 臨界處理劑量。
[0016] b.用聚乙二醇（PEG -高鈣高PH)法誘導(dǎo)胞質(zhì)-原生質(zhì)體融合 對(duì)融合時(shí)PEG的濃度、PEG用量、融合時(shí)間及融合溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到一種融合率較高 的方法。
[0017] c、采用Multiporator多功能電轉(zhuǎn)電融合儀，優(yōu)化融合參數(shù)。
[0018] 通過(guò)以上各影響因素的優(yōu)化，獲得最佳融合技術(shù)，提高胞質(zhì)-原生質(zhì)體融合率。
[0019] 4)融合體再生體系的建立 a、培養(yǎng)基的選擇： 選擇KM8P、DPD、MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。綜合比較培養(yǎng)效果及成 本，選擇最佳培養(yǎng)基。
[0020] b、培養(yǎng)方法的選擇 利用最佳培養(yǎng)基進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)和液體一固體雙層培養(yǎng)，檢測(cè)融合體形成細(xì)胞團(tuán)的 起始時(shí)間和細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)，對(duì)比分析不同培養(yǎng)方法對(duì)融合體再生的影響。
[0021] c、開(kāi)展不同激素組合對(duì)融合體細(xì)胞分裂和克隆形成的影晌的研究 以最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度的NAA，2, 4-D，6-BA三種激素，培養(yǎng)融合體，根據(jù) 原生質(zhì)體的分裂和生長(zhǎng)情況來(lái)選擇最有利于融合體分離和克隆的激素配比。
[0022] d、獲得微小愈傷后用已建立的煙草愈傷組織擴(kuò)繁、分化和生根培養(yǎng)基獲得融合體 再生植株。
[0023] 5)不育系的鑒定篩選 a.分子標(biāo)記篩選與受體基因型一致的再生植株。
[0024] b.氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)法鑒定再生植株的倍性。
[0025] C?表型及育性鑒定。 實(shí)施例
[0026] 煙草葉肉原生質(zhì)體制備技術(shù)的優(yōu)化 1. 1不同酶液組合對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響 酶解是原生質(zhì)體游離中最重要的一步，本實(shí)驗(yàn)中，以K326葉片為材料，在其他條件一 致的情況下，設(shè)計(jì)了 6種不同的酶濃度組合（表1)，其原生質(zhì)體分裂情況如下：
由表1數(shù)據(jù)可從原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力、細(xì)胞碎片、成本等多方面綜合考慮，煙草原生 質(zhì)體分離的最佳酶液組合為纖維素酶Cellulase R-10的濃度為1. 0%，果膠酶Pectinase Y-23的濃度為0. 5%。
[0027] 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響 由圖2所示：隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量不斷提高，其活率則有逐步降低的趨 勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為6h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到最高，再延長(zhǎng)時(shí)間，原生質(zhì)體產(chǎn)量不僅不再提 高，反而急速下降（圖2所示1~5)，且其活率繼續(xù)下降。因此，最佳酶解時(shí)間為6h。
[0028] 不同離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體游離的影響 在原生質(zhì)體游離中，許多外界物理因子，也是影響原生質(zhì)體游離產(chǎn)率和完整率的重要 因素。其中在原生質(zhì)體純化中，離心是關(guān)鍵的步驟，而在離心中，離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間則是 決定因子。
[0029] 表2結(jié)果顯示，離心轉(zhuǎn)速為700 r/min，離心7min是獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)率最高而且 完整率相對(duì)適中（如附圖2中7~9)。
[0030] 圖2說(shuō)明：1.酶解2h原生質(zhì)體較少；2.酶解4h原生質(zhì)體稍多；3.酶解6h 原生質(zhì)體量達(dá)到最佳；4.酶解8h原生質(zhì)體較少，破碎原生質(zhì)體增加；5.酶解lOh原生 質(zhì)體大幅減少，破碎率劇增。6.用血球計(jì)數(shù)板