亞錫熒光探頭的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 選擇性螯合Sn2+的熒光探頭。
【背景技術(shù)】
[0002] 將亞錫（Sn2+)加入到牙膏以防止牙斑和口腔疾病。發(fā)現(xiàn)Sn2+有效地抑制可造成人 體間隙牙斑內(nèi)牙齒蛀蝕的某些細(xì)菌。近來(lái)，對(duì)Sn 2+的生物作用的關(guān)注漸增，因?yàn)殄a是人體必 需的微量礦物質(zhì)，并且以最大量存在于腎上腺、肝臟、大腦、脾臟和甲狀腺中。存在一些證據(jù) 表明，錫涉及生長(zhǎng)因子和防癌。缺錫可造成生長(zhǎng)緩慢和聽(tīng)力損失，但是過(guò)量的錫積聚可不利 地影響呼吸和消化系統(tǒng)。然而，錫離子生理作用和抑菌機(jī)制的研究受限于缺乏可應(yīng)用于活 細(xì)胞-真核或原核細(xì)胞的通用Sn 2+檢測(cè)方法。
[0003] 需要在各種金屬離子存在下對(duì)Sn2+具有高度選擇性，并且在Sn2+螯合后顯示出強(qiáng) 熒光性的化學(xué)探頭。還需要用于活細(xì)胞的此類探頭。還需要使背景噪音最小化，同時(shí)在Sn 2+ 存在于活細(xì)胞中的情況下，在所述細(xì)胞中提供一致的高熒光強(qiáng)度的探頭。
[0004] 具有在細(xì)胞內(nèi)Sn2+積聚中起作用的細(xì)胞器內(nèi)的pH條件下正常工作的探頭是有利 的。
[0005] 具有合成相對(duì)容易和簡(jiǎn)單的探頭也是有利的。
[0006] 具有對(duì)生物細(xì)胞的毒性較低或至少使毒性最小化使得對(duì)于活細(xì)胞實(shí)施實(shí)驗(yàn)的探 頭是有利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過(guò)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了 Sn2+熒光探頭，解決了該需求，所述探頭包含羅丹 明B衍生物部分作為熒光團(tuán)，經(jīng)由酰胺部分連接至肼基甲酸酯基團(tuán)。此類探頭化合物的用 途表現(xiàn)為用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中Sn 2+的成像探頭，以研究Sn 2+在生物體系中的生理功能?？紤] 到另外令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即在存在Sn濃度情況下溶酶體表現(xiàn)為細(xì)胞器，此類化合物是尤其 可用的。并且考慮到該細(xì)胞器相當(dāng)酸性的微環(huán)境，與以另外方式經(jīng)受低PH引發(fā)的熒光的其 它探頭相比，本發(fā)明的探頭表現(xiàn)出高熒光強(qiáng)度并且還使背景噪音最小化。換句話講，考慮到 溶酶體的酸性，對(duì)比性探頭導(dǎo)致不可取地引發(fā)熒光發(fā)射（從而產(chǎn)生背景噪音）。
[0008] 本發(fā)明的第一方面提供了具有下式（I)的化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或鹽，所述光學(xué) 異構(gòu)體為式（I)的非對(duì)映體或?qū)τ丑w：
[0009]
[0010] 其中R1為未取代的支化或未支化的C ^C12烷基、烯基、或炔基；并且其中R2、R3、R4、 R 5、R6、和R7各自獨(dú)立地為氫或經(jīng)基。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施例中，R1為未取代的支化或未支化的C ^C1。烷基，優(yōu)選C 烷基。在 另一個(gè)實(shí)施例中，&選自甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、戊基、和己基，優(yōu)選異丁基。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，私、私、1?4、1?5、1?6、和1? 7各自獨(dú)立地選自11、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷 基、環(huán)烯基、芳基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、雜芳基，并且其中上述那些 可以是取代或未取代的。在另一個(gè)實(shí)施例中，R 2、R3、R4、R5、R6、和馬各自獨(dú)立地選自H、C i-Ci。 烷基、烯基、或炔基，并且其中上述那些可以是取代或未取代的，優(yōu)選未取代的。在另一個(gè)實(shí) 施例中，私和R 7為氫，和/或R 3、R4、R5、和R6各自獨(dú)立地選自氫、或支化或未支化的C ^ C 5 烷基，優(yōu)選未取代的(^至C 5烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R 3、R4、R5、和R6各自獨(dú)立地選自未取 代的(^至C 3烷基。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供式（II)化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或鹽，所述光學(xué)異構(gòu)體 為式（I)的非對(duì)映體或?qū)τ丑w：
[0014]
[0015] 其中R1為未取代的支化或未支化的CfC12烷基或烯基。在一個(gè)實(shí)施例中，Ri為未 取代的C1-C1。烷基，優(yōu)選地，R i為未取代的支化或未支化的C i-C；烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中， 札選自甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、戊基、和己基，優(yōu)選異丁基。
[0016] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了根據(jù)式（I)或（II)的化合物，其中所述化合物 選自：
[0017](a)叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6' -雙（二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-異吲 哚-1，9'-[9H]咕噸]-H)-基]-;
[0018](b)叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6' -雙（二甲基氨基）-3-氧代螺[1H-異吲 哚-1，9'-[9H]咕噸]-2(3H)_ 基]-;
[0019](c)甲氧基_酰胺，N_[3'，6'-雙（二乙基氨基）-3_氧代螺[1H-異B引 哚-1，9'-[9H]咕噸]-2(3H)_ 基]-;
[0020] ⑷乙氧基-酰胺，N-[3'，6' -雙（二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-異叼I 哚-1，9'-[9H]咕噸]-2(3H)_ 基]和
[0021] (e)甲氧基_酰胺，N_[3'，6' -雙（二甲基氨基）-3_氧代螺[1H-異B引 哚-1，9'-[9H]咕噸]-2(3H)_ 基]和
[0022] (f)乙氧基-酰胺，N_[3'，6' -雙（二甲基氨基）-3_氧代螺[1H-異B引 哚-1，9'- [9H]咕噸]-2 (3H)-基]_。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施例中，所述化合物選自：N-(3'，6'-雙（二乙基氨基）-3_氧代螺 [異吲哚啉-1，9'-咕噸]-2-基）丙酰胺；N-(3'，6'-雙（二乙基氨基）-3-氧代螺[異吲 哚啉-1，9'-咕噸]-2-基）丁酰胺；和N-(3'，6'-雙（二乙基氨基）-3-氧代螺[異吲哚 啉-1，9' -咕噸]-2-基）戊酰胺。
[0024] 本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了檢測(cè)生物細(xì)胞中熒光的方法，所述方法包括以下步 驟：(a)用上述化合物（例如式⑴或式（II)化合物，或所述式⑴或（II)范圍內(nèi)的優(yōu)選 或另選的化合物實(shí)施例）培養(yǎng)生物細(xì)胞；(b)用激發(fā)光照射所培養(yǎng)的細(xì)胞，優(yōu)選地，其中所 述照射光具有至少520至580nm，或560nm的波長(zhǎng)；并且（c)檢測(cè)來(lái)自化合物的560至660nm 的光射線。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包括使所述生物細(xì)胞經(jīng)受Sn 2+，另選地，其中所述 生物細(xì)胞選自口腔上皮細(xì)胞或鏈球菌（Streptococcus)屬細(xì)菌，另選地，其中所述生物細(xì) 胞為任何真核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，光發(fā)射檢測(cè)位于真核細(xì)胞溶酶體細(xì)胞器中。在又 一個(gè)實(shí)施例中，用上文或本文先前所述的至少一種特定化合物實(shí)施所述方法。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 提供了圖1 _ 5。圖I (a)和（c)為加入Sn2+后對(duì)照化合物Rl和本發(fā)明化合物R2 的熒光光譜；(b)和（d)分別為560nm激發(fā)的加入各種金屬離子后化合物Rl和R2的熒光光 譜?；衔颮l為螺[1H-異吲哚-1，9'-[9H]咕噸]-3(2H)_酮，2-[2_[雙（2-羥基乙基）氨 基]氨基]乙基]-3'，6'-雙（二乙基氨基）。化合物R2為叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6'-雙 (二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-異吲哚-1，9'-[9H]咕噸]-H)-基]_。
[0026] 圖2a和2b分別示出對(duì)照化合物Rl和本發(fā)明化合物R2 (10 y M)的580nm熒光在 不同pH范圍下的相關(guān)性。在560nm處激發(fā)。
[0027]圖3a和3b為基于KB細(xì)胞（普遍存在的角蛋白形成腫瘤細(xì)胞系HeLa的亞系） CLSM(共聚焦激光掃描顯微鏡）圖像衍生的簡(jiǎn)化示圖。（al-cl)和（a2_c2)細(xì)胞分別用 10 yM對(duì)照化合物Rl和本發(fā)明化合物R2培養(yǎng)30分鐘，然后（dl-fl)和（d2-f2)用50 yM 3必2進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘。收集560 - 660nm的紅色信道射線（bl、el、b2、e2) ;al、dl、a2、d2 分別為明視場(chǎng)圖像，并且cl、fl、c2、f2分別為疊加圖像（A ex = 543nm)。任何觀察到的熒 光均是紅色的。
[0028] 圖4為對(duì)比共定位實(shí)驗(yàn)中基于KB細(xì)胞CLSM圖像衍生的簡(jiǎn)化示圖。（al-dl)細(xì)胞連 續(xù)用 50 y M SnF2、10 y M 對(duì)照化合物 Rl 和 I y M LysoTracker1'' Green DND 各自培養(yǎng) 30 分 鐘；（a2-d2)連續(xù)用 50 y M SnF2、10 y M 本發(fā)明化合物 R2 和 I y M LfSOTracker? Green DND 各自培養(yǎng)30分鐘。收集560 - 660nm(Aex = 543nm)的紅色信道（bl，b2)或500-540nm (入ex = 488nm)的綠色信道的射線；al、a2分別為明視場(chǎng)圖像，并且dl，d2分別為疊加圖像。觀 察到的熒光為：bl、b2中的紅色；cl、c2中的綠色；以及dl、d2中的黃色。
[0029] 圖5a和5b示出基于變異鏈球菌（Str印tococcus) (ATCCk700610?) CLSM圖像 衍生的簡(jiǎn)化示圖。示圖未按比例繪制，而且為了進(jìn)行示意性的說(shuō)明進(jìn)行了放大。（al-cl)和 (a2-c2)細(xì)胞分別用10 y M對(duì)照化合物Rl和本發(fā)明化合物R2培養(yǎng)30分鐘，然后（dl-fl) 和（d2-f2)用50 yM 3必2進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘。收集560 - 660nm的紅色信道射線（bl、el、 b2、e2) ;al、dl、a2、d2分別為明視場(chǎng)圖像，并且cl、fl、c2、f2分別為疊加圖像Uex = 543nm)〇
【具體實(shí)施方式】
[0030]定義：
[0031] 就本發(fā)明目的而言，本文術(shù)語(yǔ)"烴基"定義為由碳原子和氫原子構(gòu)成的任何有機(jī)單 元或部分。術(shù)語(yǔ)烴基中包括雜環(huán)。各種未取代的非雜環(huán)烴基單元的非限制性示例包括戊基、 3_乙基辛基、1，3_二甲基苯基、環(huán)己基、順式_3_己基、7, 7_二甲基雙環(huán)[2. 2. 1]-庚-1-基、 和萘-2-基。"烴基"定義中包括芳族（芳基）和非芳族碳環(huán)環(huán)。術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"包括芳族（雜 芳基）和非芳族雜環(huán)環(huán)。
[0032] 術(shù)語(yǔ)"取代的"用于整個(gè)說(shuō)明書(shū)中。本文術(shù)語(yǔ)"取代的"定義為"涵蓋可置換烴基 部分的一個(gè)氫原子、兩個(gè)氫原子、或三個(gè)氫原子的部分或單元。取代的還可包括兩個(gè)相鄰 碳上氫原子的置換以形成新的部分或單元。"例如，需要單個(gè)氫原子置換的取代單元包括鹵 素、羥基等。兩個(gè)氫原子置換包括羰基、肟基等。相鄰碳原子的兩個(gè)氫原子置換包括環(huán)氧 基等。三個(gè)氫置換包括氰基等。環(huán)氧單元是需要置換相鄰碳上氫原子的取代單元示例。術(shù) 語(yǔ)"取代的"用于本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中以表示，烴基部分，特別是芳族環(huán)、烷基鏈，可具有一個(gè)或 多個(gè)被取代基取代的氫原子。當(dāng)部分被描述為"取代的"時(shí)，可置換任何數(shù)目的氫原子。例 如，4-羥基苯基為"取代的芳族碳環(huán)環(huán)"，（N，N-二甲基-5-氨基）辛基為"取代的