[0030] (二）、雜交群體分離表型的鑒定
[0031] 本發(fā)明以雜交群體美錦（普通生長(zhǎng)型）X99-41-63 (溫度敏感型半矮生桃）的186 個(gè)單株F1代的分離群體（普通生長(zhǎng)型95株；溫敏型半矮生桃91株）為研究材料，表型評(píng) 價(jià)分別在4月-5月和6月初進(jìn)行。半矮生型具體表型為4-5月節(jié)間長(zhǎng)度極短，6月初后節(jié) 間長(zhǎng)度恢復(fù)普通生長(zhǎng)型。通過(guò)生長(zhǎng)特征確定半矮生型和普通生長(zhǎng)型。
[0032](三）、基因組DNA的提取，SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、目標(biāo)性狀的定位
[0033] (1)基因組DNA的提取
[0034]采用CTAB法提取桃葉片基因組DNA，略作修改，具體如下：（1)取新鮮或者硅膠干 燥的葉子，放入玻璃碾缽中，加入液NjPPVP進(jìn)行碾磨，直至碾磨細(xì)粉狀為止；（2)用未污染 的小匙將碾碎的葉片粉末轉(zhuǎn)入2mL離心管，再加入配制好的CTAB液1300yL和6yL0 -巰 基乙醇，進(jìn)行l(wèi)h長(zhǎng)的65°C水浴，其間約每lOmin輕搖勻；（3)加入氯仿和異戊醇混合液，體 積比為24:1，直至2mL的離心管滿載線，后緩慢（防止剪裂）顛倒混勻10分鐘。放入冷凍離 心機(jī)（Eppendorf5810R)4°C條件下，lOOOOrpm,離心10分鐘；（4)吸取上清液，轉(zhuǎn)入2mL的 離心管，加入氯仿、異戊醇和苯酚的混合液，體積比為24:1:25,直至離心管滿載線，輕輕顛 倒搖勾lOmin。放入冷凍離心機(jī)（Eppendorf5810R)，4°C條件下，lOOOOrpm,離心10分鐘； (5)再次吸取上清液，轉(zhuǎn)入2.OmL的離心管，加入氯仿和異戊醇的混合液，體積比為24:1，直 至離心管滿載線，輕輕顛倒搖勾lOmin。放入冷凍離心機(jī)（Eppendorf5810R)，4°C條件下， lOOOOrpm，離心10分鐘；（6)三次抽提后，用200yL的移液器小心吸取上清液于1. 5mL管 中，加入約150yL的NaAc和等體積的預(yù)冷異丙醇（混勻），于-20°C冰箱1小時(shí)；（7)將上 述1. 5mL離心管放入冷凍離心機(jī)（Eppendorf5810R)，4°C條件下，12000rpm,離心10分鐘， 棄上清液；(8)在帶有沉淀的離心管中加入500yL的70%的乙醇，lOOOOrpm瞬時(shí)離心，洗 滌沉淀2次，加入無(wú)水乙醇洗滌沉淀一次，用200yL移液器（Eppendorf)吸除離心管底部 剩余無(wú)水乙醇，后自然晾干；（9)在室溫下自然風(fēng)干沉淀后，加入100yL體積的0. 1XTE溶 解沉淀DNA，同時(shí)加入0. 5yL的RNase，37°C放置lh，祛除RNA污染（長(zhǎng)期保存在-20°C冰 箱，常用則存于 4°C冰箱）；（10)米用NanoDroplOOOspectrophotometer(Themo)和 1% 的 瓊脂糖膠對(duì)提取的DNA進(jìn)純度濃度和完整度進(jìn)行檢測(cè)，并稀釋成工作液濃度（25ng/yL)， 以用于后續(xù)研究。
[0035] (2)SNP開(kāi)發(fā)的引物設(shè)計(jì)
[0036] 參考GenomeDatabaseforRosaceae數(shù)據(jù)庫(kù)的桃基因組序列，米用primer3Web Version4. 0(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物，引物參數(shù)為退火溫度在60_63°C之間，弓丨 物長(zhǎng)度20-23bp，開(kāi)發(fā)基于Sanger測(cè)序的SNP標(biāo)記，選擇每1Mb設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度約為1600bp。
[0037] (3)PCR反應(yīng)體系以及SNP標(biāo)記的獲得
[0038]PCR擴(kuò)增體系總體積為40yL，具體組分如下：
[0039]
[0040] 混勾后，在離心機(jī)（5810R，Eppendorf)離心，并在PCR儀（Eppendorf)上進(jìn)行擴(kuò) 增。？0?擴(kuò)增程序?yàn)?5￡€31^11;941€3〇8,56 1€3〇8,721€9〇8,34個(gè)循環(huán)；72°(：1〇111111。
[0041] 我們對(duì)父母本、后代各兩個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后，送Invitrogen生 物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)測(cè)定序列信息在Contig軟件中打開(kāi)，序列對(duì)齊后尋找多態(tài) 性SNP標(biāo)記。
[0042](四）、目標(biāo)性狀緊密連鎖標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
[0043] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，我們尋找緊密連鎖的SNP標(biāo)記，具體基因型表現(xiàn)為，普通生長(zhǎng)型 母本基因型為aa、父本基因型為Aa，兩個(gè)子代分別與親本基因型一致，在4個(gè)子代中獲得 緊密連鎖的SNP標(biāo)記后，擴(kuò)大至分離后代各20個(gè)單株中，確定緊密連鎖后進(jìn)一步擴(kuò)大至全 部樣品中，進(jìn)而確定緊密連鎖的SNP標(biāo)記后，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，采用JionMapversion 3. 0(VanOoijenandVoorrips2001)計(jì)算遺傳距離。在精細(xì)定位區(qū)間依據(jù)父母本的基因 型和表型開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，用于區(qū)分不同雜交后代單株，確立完全連鎖的SNP標(biāo)記。
[0044] 表1本發(fā)明所采用緊密連鎖SNP標(biāo)記的引物序列
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度緊密連鎖的SNP標(biāo)記，其特征在于所獲得的緊 密連鎖SNP標(biāo)記為SNP260k-l和SNP260k-13,分別位于桃基因組Scaffold 3的2. 850Mb和 3. 003Mb 處。2. 權(quán)利要求1所述SNP標(biāo)記在調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度中的應(yīng)用。3. -種鑒定與調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度的引物對(duì)，其特征在于如下所示： SNP260k-l 的引物對(duì)為：5-AGGGTITCATGGCGTTAAAGC-3 ; 5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3 ； SNP260k-13 的引物對(duì)為：5-CTTITCTCCGCCGCGTTAAT-3 ; 5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3 〇4. 權(quán)利要求3所述引物對(duì)在鑒定與調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求3所述引物對(duì)在鑒定如權(quán)利要求1所述與調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度緊 密連鎖的SNP標(biāo)記中的應(yīng)用。6. 含有權(quán)利要求3所述引物對(duì)的試劑盒。
【專利摘要】一種與調(diào)控溫敏半矮生型桃節(jié)間長(zhǎng)度緊密連鎖的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，采用雜交群體美錦(普通生長(zhǎng)型)×99-41-63(溫度敏感型半矮生桃)的186個(gè)單株F1代的分離群體(普通生長(zhǎng)型95株；溫敏型半矮生桃91株)為研究材料，結(jié)合基于SNP的第三代標(biāo)記技術(shù)，采用圖位克隆的方法，對(duì)調(diào)控溫敏型半矮生桃節(jié)間長(zhǎng)度的基因進(jìn)行了精細(xì)定位。在精細(xì)定為區(qū)域內(nèi)，獲得了緊密連鎖SNP標(biāo)記SNP260k-1和SNP260k-13，分別位于桃Scaffold？3的2.850Mb和3.003Mb處。通過(guò)上述方式，本發(fā)明能夠應(yīng)用于早期目標(biāo)性狀的分子鑒定，可為桃株高的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105112526
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510534222
【發(fā)明人】魯振華, 王志強(qiáng), 牛良, 崔國(guó)朝, 曾文芳, 潘磊
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所
【公開(kāi)日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年8月27日