一種用于動物藥材dna條形碼鑒定的方法及pcr試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種PCR試劑盒，尤其涉及一種可用于藥典動物藥材DNA條形碼鑒定 的PCR試劑盒和鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥鑒定是研究中藥品種、質(zhì)量，制定中藥標(biāo)準(zhǔn)，尋找和擴(kuò)大藥源的前提和基礎(chǔ)。 中藥四大傳統(tǒng)鑒定方法為基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定，這些傳統(tǒng)鑒定方法的 理論基礎(chǔ)建立于分類群的性狀特征分析，這些性狀特征是與環(huán)境緊密相關(guān)的表現(xiàn)型，鑒定 結(jié)果易受主觀和客觀因素影響。
[0003] 基因組DNA序列是物種形貌和基本性質(zhì)的基礎(chǔ)和決定因素，也是不同生物的不可 變"身份證"，為動植物分類和鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)。DNA條形碼（DNAbarcoding)技術(shù)是 通過PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增基因組序列中一段通用DNA片段，對PCR擴(kuò)增的通用DNA片段進(jìn)行 比較分析來完成物種快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定。DNA條形碼技術(shù)是近年來生物分類和鑒定的 研究熱點(diǎn)，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。目前，利用C0I序列對動物類藥材進(jìn)行 鑒定已經(jīng)取得了廣泛的成功。
[0004] 但中國藥典動物藥材品種多樣、取材部位廣泛（肌肉、角、骨、甲、殼等），并且樣本 多為不新鮮樣本，造成基因組樣本異質(zhì)性高、DNA含量低、含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑且有不 同程度降解，用現(xiàn)有的PCR擴(kuò)增條件有相當(dāng)一部分樣品得不到相應(yīng)的基因片段產(chǎn)物，從而 無法進(jìn)行后續(xù)的DNA條形碼鑒定工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服中藥材樣本間基因組異質(zhì)性高、基因組DNA豐度低及含PCR反應(yīng)抑制劑 的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種動物藥材DNA條形碼鑒定的方法及PCR試劑盒，能夠?qū)χ袊幍鋭?物藥材中不容易擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物的樣本進(jìn)行有效的擴(kuò)增，從而利用DNA條形碼對中藥進(jìn) 行鑒定。
[0006] 本發(fā)明第一個方面是提供一種用于動物藥材DNA條形碼鑒定的PCR試劑盒，包括 PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑，所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑包括牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇、甜菜堿、乙基苯基聚 乙二醇。
[0007] 在本發(fā)明第一個方面的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述PCR試劑盒中，每微升體積包括：
[0008] 牛血清白蛋白60-100yg，優(yōu)選為70-95yg，優(yōu)選為75-90yg，優(yōu)選為80-85yg ; 二硫蘇糖醇5-14ymol，優(yōu)選為6-13ymol，優(yōu)選為7-12ymol，優(yōu)選為8. 5-10ymol;甜菜堿 0? 5-1. 5mol，優(yōu)選為0? 6-1. 4mol，優(yōu)選為0? 8-1. 3摩爾，優(yōu)選為1. 0-1. 2mol;乙基苯基聚乙 二醇 0.l-lwt%，優(yōu)選為 0. 2_0. 8wt%，優(yōu)選為 0. 3_0. 6wt%，優(yōu)選為 0. 4_0. 5wt%。
[0009] 本發(fā)明所述的PCR試劑盒，還可以包括擴(kuò)增引物。
[0010] 在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述引物為：
[0011]引物R:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
[0012] 引物F:TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0013] 本發(fā)明所述的PCR試劑盒，還可以包括緩沖液、DNA聚合酶、dNTP中的任意一種或 幾種。
[0014] 本發(fā)明第二個方面是提供一種用于動物藥材DNA條形碼鑒定的方法，包括：提供 模板DNA，所述模板DNA源自動物藥材；
[0015] 進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)體系包括：所述模板DNA、緩沖液、dNTP、擴(kuò)增引物、 DNA聚合酶以及所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑；
[0016] 鑒定DNA。
[0017] 其中，所述PCR反應(yīng)體系中，包括：
[0018]
[0019]
[0020] 其中，所述PCR反應(yīng)中，程序包括：
[0021] 94〇C,lmin--(94〇C,lmin--45〇C, 1. 5min--72°C，lmin)進(jìn)行 5 個循環(huán)；
[0022] 94°C，30s--（50°C，30s--72°C，lmin)進(jìn)行 35 個循環(huán)；
[0023] 72〇C,5min；
[0024] 結(jié)束。
[0025] 本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述模板DNA可以是選自動物的肉、角、骨、甲、殼等物質(zhì)中的 任意一種或幾種。
[0026] 本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述動物藥材可以是包括如下種類中的任意一種或幾種：羚 羊角、水牛角、鹿茸、鹿角、紫河車、土鱉蟲、水牛角、海龍、鱉甲、龜甲、熊膽粉、穿山甲、金錢 白花蛇、烏梢蛇、蘄蛇、蛇蛻、海馬、地龍、僵蠶、九香蟲、蜈蚣、桑螵蛸、蛤蚧、雞內(nèi)金、斑蝥、全 蝎、水蟲至。
[0027] 本發(fā)明所述的用于動物藥材DNA條形碼鑒定的PCR試劑盒及鑒定方法，對低豐度 難擴(kuò)增中藥樣本，尤其是DNA條形碼鑒定中的困難樣本，如：水牛角、羚羊角、龜甲、鱉甲、穿 山甲、蛇蛻等，能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴(kuò)增，保證DNA條形碼鑒定技術(shù)接近100 %的擴(kuò)增成功率，使 DNA條形碼技術(shù)得到更為廣泛的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例1和對比例1中PCR擴(kuò)增結(jié)果對比。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為了克服中藥材樣本間基因組異質(zhì)性高、基因組DNA豐度低及含PCR反應(yīng)抑制劑 的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種PCR增強(qiáng)試劑盒和鑒定方法，能夠?qū)χ袊幍鋭游锼幉闹胁蝗菀?擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物的樣本進(jìn)行有效的擴(kuò)增，從而利用DNA條形碼對中藥進(jìn)行鑒定。下面通 過具體實(shí)施例對本發(fā)明PCR增強(qiáng)試劑盒以及鑒定方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，但是應(yīng)當(dāng)理 解的是，下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] PCR反應(yīng)體系：
[0032]
[0033] 其中，引物為：
[0034]引物R:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
[0035]引物F:TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0036] 其中，增強(qiáng)劑包括：牛血清白蛋白80微克每微升；二硫蘇糖醇10微摩爾每微升； 0. 5% NP40 ;甜菜堿1摩爾每微升。
[0037] PCR反應(yīng)程序設(shè)置
[0038] m°Q 1min 94°C 1min 45°C 1.5min 72°CIrnin
[0039] Goto ：2 for 5 cycles
[0040] 94 °C 30s
[0041] 50 °C 30s
[0042] 72 °C lmin
[0043] Goto ：6 for 35 cycles
[0044] 72 °C 5min
[0045]END
[0046] 對比例1
[0047]
[0048]
[0049] 按照實(shí)施例1所述的引物和PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0050] 圖1給出了實(shí)施例1和對比例1的PCR擴(kuò)增結(jié)果對比，其中，通道1為Marker，通 道2為陰性對照，通道3為對比例1的PCR擴(kuò)增結(jié)果，通道4為實(shí)施例1的PCR擴(kuò)增結(jié)果。 從圖中可以看出，加入本發(fā)明增強(qiáng)劑之后，出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增條帶，DNA條形碼鑒定成功。
[0051] 實(shí)施例2
[0052] PCR反應(yīng)體系：
[0053]
[0054] 其中，引物為：
[0055]引物R:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
[0056]引物F:TAAACTTTCAGGGTGACCAAA