番茄早疫病菌pcr檢測特異引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及番茄早疫病菌PCR檢測特異引物及其檢測方法，屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]番蔽{So Ianum lycopersicum L.)是全球廣泛種植，高消費量的蔬菜作物之一，中國是番茄出口大國，在南北均有大面積栽培。番茄果實營養(yǎng)極為豐富，品種類型較多，既能作為水果生食，也能作蔬菜成為餐桌上的美味佳肴，還能被加工成番茄醬、番茄汁等功能性罐裝食品，為消費市場創(chuàng)造了良好的經(jīng)濟效益。隨著栽培技術(shù)的進步，近年來主要通過保護地栽培模式生產(chǎn)番茄供應(yīng)市場，優(yōu)良的生長環(huán)境一方面延長了番茄的生長周期，促進了番茄生產(chǎn)，另一方面卻滋生番茄病害的發(fā)生，破壞番茄植株的生長，威脅番茄的產(chǎn)量及品質(zhì)甚至在采后儲藏期造成危害。
[0003]由前鏈格孢菌IMtermria solani{E\A,Mhaxt).sorauer]侵染引起的番前早疫病是番茄生產(chǎn)上的主要病害之一，也是一種世界性病害，在美國、澳大利亞、以色列、印度、希臘等地發(fā)病率都很高，嚴重時可使產(chǎn)量損失35%-78%，80年代以來在我國黑龍江、吉林、山東、河北、山西、廣東、湖北、江蘇和福建等大部分地區(qū)也普通發(fā)生，危害日趨嚴重，一般年份發(fā)病率在10%左右，造成產(chǎn)量損失10%-30%，流行年份發(fā)病率可達100%，產(chǎn)量損失可達30%-40%，甚至絕收，成為露地、保護地番茄生產(chǎn)中的重要病害。番茄早疫病菌主要以菌絲和分生孢子隨病株殘體在土壤中越冬，氣候條件適宜時，產(chǎn)生新的分生孢子是初侵染的來源，病斑上的分生孢子主要靠風(fēng)雨等傳播，通過氣孔或傷口侵入，在條件適宜時，病菌侵入寄主后只需2-3天就可形成病斑，再經(jīng)過3-4天即可產(chǎn)生大量的分生孢子，引起多次重復(fù)侵染。該病可以引起落葉、落花、落果和斷技，對產(chǎn)量影響很大，嚴重時可以使產(chǎn)量損失50%以上，隨著番茄早疫病的出現(xiàn)及其日益嚴重，因此，很有必要建立一套快速靈敏的檢測方法用于番茄早疫病的早期診斷，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，對番茄早疫病的及時控制具有重要意義。
[0004]為控制番茄早疫病的發(fā)生為害，世界各國踴躍開展了番茄早疫病菌的檢測研究，傳統(tǒng)的檢測方法是采用選擇性培養(yǎng)基從發(fā)病組織中分離病原菌，再對這些病原菌的形態(tài)特征等進行鑒定，或者利用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對發(fā)病癥狀進行判定。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員具有豐富的經(jīng)驗，不能滿足病害防治中病原菌準確、快速檢測的需求，易遺漏潛育期或隱癥的病害，以致延誤病害的防治，導(dǎo)致病害的暴發(fā)。因此，對番茄早疫病菌的檢測、鑒定就需要在病害發(fā)病初期或在癥狀顯現(xiàn)之前來進行，這樣就要求有靈敏、快速的方法。
[0005]隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等技術(shù)優(yōu)勢的PCR(聚合酶反應(yīng)polymerase chain react1n)技術(shù)已逐步應(yīng)用于植物病原菌的快速檢測、鑒定，如柑橘黃龍病菌、柑橘潰瘍病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌等等。然而，通過對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚未有利用PCR技術(shù)檢測番茄早疫病菌的報道。本發(fā)明通過對鏈格孢屬(Wferaaria)真菌的ITS序列進行比對分析，設(shè)計出I對可用于特異性檢測番前早疫病菌的引物，為番茄早疫病菌的準確鑒定和快速檢測提供技術(shù)和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中對番茄早疫病菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征、耗時長、程序繁瑣、經(jīng)驗性強、準確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，提供了一種番茄早疫病菌PCR檢測特異引物及其檢測方法，利用本發(fā)明所述的PCR檢測特異引物進行番茄早疫病菌檢測和鑒定具準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、檢測時間短且結(jié)果可靠。
[0007]實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟(技術(shù)方案):
1.番前早疫病菌(Altermrieisolani) PCR檢測特異引物的設(shè)計
采用真核生物ITS通用引物ITS1:5’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’和ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’對番茄早疫病菌和鏈格孢屬Uheraaria印/?)真菌中不同種以及其它病原菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因進行擴增，PCR反應(yīng)體系25 μ?,包括2Χ T1a^7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10 Mmol/L的ITSl/ITS4引物各1.0μ?，2.0X 10 5?200 ng DNA模板，用無菌超純水補足至25 μ?。擴增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性I min、55°C退火30 S、72°C延伸I min，35個循環(huán)，最后72°C延伸10 Hiin0將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序得到的ITS序列與GenBank中Wteraaria屬不同種的ITS基因序列進行同源性比較分析，根據(jù)基因序列差異位點，用Primer Primer5軟件設(shè)計出番茄早疫病菌PCR檢測特異引物，基喊基序列為:
上游引物 ASF:5’ - ACCACAAGGACCAACCCATA -3’，
下游引物 ASR:5’- CCTACCTGATCCGAGGTCAA -3’ ；
2.番茄早疫病菌PCR快速分子檢測的建立
Cl)提取待測樣品(病原菌純培養(yǎng)物、帶菌植物組織或土壤)基因組DNA。
[0008]用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下:取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中(菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜)，加入900 μ?2%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20mmol/L EDTA, ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸鈉)【注:CTAB, SDS需60°C預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60°C水浴Ih (DNA釋放至緩沖液中)，12000 r.min 1離心15 min ;取上清液700 μ?，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液(各體積比為25:24:1 )，輕輕振蕩混勾，12000 r.min1離心9 min;取上清液500 KL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000r.min 1離心5 min ;取上清液350 KL，加入1/10體積3 mol.L 1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀30 min，12000 r.min1離心5 min ;棄去上清液，加入700μ?體積濃度為70%冰乙醇進行洗滌(稍離心；傾掉上清液)，在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μ? TE(10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至25 ng/^L待用。
[0009]用于檢測番茄植株組織是否存在番茄早疫病菌時，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株組織基因組DNA，具體過程如下:向1.0 mg番茄植株組織(花、葉或果實)中加入0.5mol/L NaOH 30 KL，將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，12，000 rpm離心6 min,取上清液5 μ?加入0.1 mol/L Tris-HCl (ρΗ=8.0)495μ?混合均勻，取1.0 μ?作為PCR模板進行擴增；
用于檢測土壤中是否存在番茄早疫病菌時，采用土壤DNA提取法提取土壤中總微生物基因組DNA，具體過程如下:取已過200目篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 μ?質(zhì)量濃度為0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12，000 rpm離心15 min,取上清液加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為lOPg/mL蛋白酶K，55°C水浴60min，水浴結(jié)束后，加入總體積為1/2體積的7.5M NH4AC溶液，上下顛倒混勾，12，000 rpm離心15 min，吸上清液加2倍體積無水乙醇-20°C沉淀20min以上，沉淀結(jié)束后，12，000 rpm離心10 min，傾掉上清液，用體積濃度為70%乙醇洗滌沉淀，室溫涼干，每份樣品所提DNA用20 μ? TE (或無菌超純水)溶解，取1.0PL作為PCR模板進行擴增。
[0010](2)以步驟(I)提取的DNA為模板，利用ASF/ASR這一對引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系25 μ?，包括2Xrai7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10Mmol/L的ASF/ASR引物各1.Ομ?，2.0 X 10 5?200 ng DNA模板【1.Ομ?步驟(I)提取的基因組DNA】，用無菌超純水補足至25 PL;擴增參數(shù)為:95 °C預(yù)變性5 min, 94 °C變性30 S，60 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 °C延伸10 min。
[0011](3)取步驟(2)的PCR擴增產(chǎn)物5.0 μ?用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電泳結(jié)束后經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無及其片段大小對結(jié)果進行判斷，如果能特異性地擴增出約409bp的產(chǎn)物，即可判斷所述的檢測樣品中存在番茄早疫病菌，否則所述的檢測樣品中未存在番茄早疫病菌。
[0012]本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和有益效果:
1.特異性強、準確性高:本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer, ITS)序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點，設(shè)計了對番茄早疫病菌具有特異擴增作用的PCR引物，并已經(jīng)對不同地理來源的番茄早疫病菌和攜帶該病菌的番茄葉片和土壤進行了測試驗證，只有番茄早疫病菌和攜帶該病菌的番茄葉片或土壤中能特異性地擴增出一條409bp的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計的引物具有很強的特異性和準確性。
[0013]2.靈敏度高:病原菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定等步驟，這種傳統(tǒng)方法的成功需要發(fā)病組織中積累到足夠量的病原體才能成功。而本發(fā)明以多拷貝的ITS基因為番茄早疫病菌PCR分子檢測的靶標，將設(shè)計的特異引物與ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)聯(lián)合起來進行巢式PCR擴增后，對番茄早疫病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg，比常規(guī)PCR檢測提高了 10000倍。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明所要檢測的番茄早疫病菌的特異PCR擴增圖，圖中:泳道M為2000bp DNA Marker,泳道1_3為番前早疫病菌iAltenrnriEi solani'),泳道4_6分別為格樹黑斑病菌1.ZllterimriB alternata),番前灰霉病菌iBotrytis ciflerea)和番前晚疫病菌(Phytoph thora infes tans')。
[0015]圖2為本發(fā)明番茄早疫病菌的靈敏性檢測擴增結(jié)果圖，圖2-a為單重PCR對番茄早疫病菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖2-b為巢式PCR對番茄早疫病菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道I為100 ng,泳道2為10 ng,泳道3為I ng，泳道4為100 pg,泳道5為10 pg,泳道6為I pg，泳道7為100 fg，泳道8為10 fg，泳道9為I fg，泳道10為陰性對照。
[0016]圖3為本發(fā)明發(fā)病組織的檢測結(jié)果圖，圖中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道I為陽性對照，泳道2為番茄早疫病菌純培養(yǎng)物，泳道3為發(fā)病的番茄葉片，泳道4為攜帶番茄早疫病菌的土壤，泳道5-6為健康番茄葉片，泳道7為無菌土樣，泳道8為陰性對照。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，或已發(fā)表相關(guān)文獻中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照廠商所建議的