一種利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的工程菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及工程菌株構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的工程 菌株的構(gòu)建方法，還涉及得到的工程菌株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯酚是一種重要的基本有機(jī)化工原料，主要用于生產(chǎn)酚醛樹脂、雙酚A和己內(nèi)酰 胺、己二酸、苯胺等；苯酚衍生物如鹵代酚、硝基酚、烷基酚可用于醫(yī)藥、染料、香料以及各種 添加劑等的生產(chǎn)，因此苯酚市場(chǎng)具有良好的發(fā)展前景。
[0003] 甘油又稱丙三醇，分子式C3H5(0H)3，是一種粘稠液體，有甜味，能與水以任意比混 溶，有強(qiáng)烈的吸濕性。甘油資源豐富、價(jià)格低廉，由于其C原子的高度還原性，在燃料和化學(xué) 品生產(chǎn)中具有比普通糖如葡萄糖更高的收益，所以已經(jīng)成為一個(gè)有吸引力的原料。
[0004]目前，世界上苯酚的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)法合成：異丙苯法、甲苯-苯甲酸法、苯 直接氧化法、苯硼酸法以及環(huán)己酮-環(huán)己醇法。其中異丙苯法是目前最主要的苯酚生產(chǎn)方 法，生產(chǎn)能力占世界苯酚總生產(chǎn)能力的90%以上。其工藝步驟是：苯和丙烯反應(yīng)合成異丙 苯；異丙苯經(jīng)氧氣或空氣氧化，生成過氧化氫異丙苯（CHP) ;CHP分解生成苯酚和丙酮。副產(chǎn) 物丙酮具有毒性，所以化學(xué)法合成苯酚存在生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染大、副產(chǎn)物多等一系列問 題。
[0005] 苯酚的生物合成由于自身毒性對(duì)微生物的傷害而受到了限制，因此關(guān)于生物法合 成苯酚的研究較少。目前，國(guó)外已有關(guān)于以葡萄糖為原料生產(chǎn)苯酚的報(bào)道，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn) 報(bào)道（ByoungjinKim,HyegwonPark,DokyunNa,SangYupLee.Metabolicengineering ofEscherichiacolifortheproductionofphenolfromglucose.Biotechnol Journal, 2014, 9, 621 - 629.)，ByoungjinKim利用葡萄糖生產(chǎn)苯酸的最高效價(jià)達(dá)到3. 79g/ L，但是沒有利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)法生產(chǎn)苯酚存在的生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染大、副產(chǎn) 物多等問題，及生物法合成苯酚的研究較少的現(xiàn)狀，本發(fā)明以甘油為原料，研究了一種利用 甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的工程菌株的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述得到的工程菌株的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的：
[0009] 大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)苯酚的途徑如圖1所示，其中涉及打通代謝條路的兩個(gè)關(guān) 鍵酶基因?yàn)閠pl(編碼酪氨酸苯酚裂解酶）和p4m(編碼苯丙氨酸-4-單加氧酶），酪氨酸 苯酚裂解酶催化酪氨酸生成苯酚，苯丙氨酸-4-單加氧酶則催化苯丙氨酸生成酪氨酸。涉 及利用甘油生產(chǎn)苯酚的兩個(gè)基因?yàn)間lpX(編碼果糖-1，6-二磷酸酶）和tktA(編碼轉(zhuǎn)酮醇 酶）。果糖-1，6-二磷酸酶催化1，6-二磷酸果糖生成6-磷酸果糖，轉(zhuǎn)酮醇酶催化6-磷酸 果糖生成4-磷酸赤蘚糖。
[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)苯酚的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，該菌 株共表達(dá)酪氨酸苯酚裂解酶（tpl基因編碼）和苯丙氨酸-4-單加氧酶（p4m基因編碼）。
[0011] 所述酪氨酸苯酚裂解酶的氨基酸序列具體如序列表中的序列1所示，共由456個(gè) 氨基酸組成；
[0012] 所述酪氨酸苯酚裂解酶的編碼基因是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的，其基因序列具體如序列 表中的序列2所示，共由1373個(gè)核苷酸組成；
[0013] 所述苯丙氨酸-4-單加氧酶的編碼基因序列具體如序列表中的序列3所示，共由 789個(gè)核苷酸組成。
[0014] -種生產(chǎn)苯酚的大腸桿菌工程菌株P(guān)H1的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法如下：
[0015] (1)選取酪氨酸苯酚裂解酶（tpl)的⑶S全序列，經(jīng)過設(shè)計(jì)和反復(fù)驗(yàn)證得到適合于 在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化型酪氨酸苯酚裂解酶基因序列，上述優(yōu)化為在不改變相應(yīng)酶的氨 基酸序列的前提下，將野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好（高頻使用）的密碼子優(yōu) 化序列，從而提高酪氨酸苯酚裂解酶在大腸桿菌培養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)水平。
[0016] (2)將tpl和p4m基因分別通過酶切位點(diǎn)KpnI、PstI和PstI、HindIII 克隆在pTrc99a中，得到重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl_p4m。將重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl_p4m 電轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)室的高產(chǎn)苯丙氨酸菌株E.coliATCC31884,獲得重組菌命名為PHI即 ATCC31884-pTrc99a-tpl-p4m〇
[0017] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效利用甘油生產(chǎn)苯酚的大腸桿菌工程菌株的 構(gòu)建方法，該菌株在表達(dá)酪氨酸苯酚裂解酶（tpl基因編碼）和苯丙氨酸-4-單加氧酶（p4m 基因編碼）的基礎(chǔ)上，高表達(dá)果糖-1，6-二磷酸酶（glpX基因編碼）和轉(zhuǎn)酮醇酶（tktA基 因編碼），提高了工程菌株對(duì)甘油的利用效率。
[0018] -種高效利用甘油生產(chǎn)苯酚的大腸桿菌工程菌株P(guān)H2的構(gòu)建方法如下：
[0019] (1)高產(chǎn)苯丙氨酸菌株E.coliATCC31884基因組DNA的提取
[0020] 取5mLE.coliATCC31884菌株的菌液，12000rpm，離心lmin，棄去上清，采用細(xì)菌 基因組DNA提取試劑盒提取E.coliATCC31884菌株基因組DNA。
[0021] (2)glpX和tktA基因的PCR擴(kuò)增
[0022] 以步驟⑴提取到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)，并采用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，獲得目的基因glpX和tktA。
[0023] (3)以pTrc99a質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物為trc啟動(dòng)子。
[0024] (4)以步驟⑵獲得的glpX基因和步驟（3)獲得的PCR產(chǎn)物為模板，通過Overlap PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物為trc啟動(dòng)子插入到glpX基因上游。
[0025] (5)將步驟⑷獲得的PCR產(chǎn)物和步驟⑵獲得的目的基因tktA分別 通過酶切位點(diǎn)KpnI、BamHI和BamHI、XbaI克隆在pTrc99a中，得到中間質(zhì)粒 pTrc99a-trcglpX_tktA〇
[0026] (6)以重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-p4m為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物為 tpl_p4m基因。
[0027] (7)將步驟（6)獲得的PCR產(chǎn)物通過酶切位點(diǎn)BspHI、SacI克隆在步驟（5)獲 得的中間質(zhì)粒pTrc99a_trcglpX_tktA中，得到重組質(zhì)粒pTrc99a_tpl-p4m-trcglpX-tktA。 將重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX_tktA電轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)室的高產(chǎn)苯丙氨酸菌株E.coli ATCC31884,獲得重組菌命名為PH2 即ATCC31884-pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX-tktA(即tpl和p4m基因由一個(gè)trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，glpX和tktA基因由另外一個(gè)trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)）。
[0028] 為進(jìn)一步增強(qiáng)苯酚合成能力，提高苯酚合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量，在PH2菌株的基礎(chǔ) 上，對(duì)質(zhì)粒上的p4m基因額外增加trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，構(gòu)建過程如下：
[0029] (1)以pTrc99a質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物為trc啟動(dòng)子。
[0030] (2)以pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX_tktA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn) 物。
[0031] (3)將步驟⑴獲得的PCR產(chǎn)物通過酶切位點(diǎn)XhoI和NcoI克隆在步驟（2) 獲得的PCR產(chǎn)物中，得到重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-trcp4m-trcglpX_tktA。將重組質(zhì)粒 pTrc99a-tpl-trcp4m-trcglpX_tktA電轉(zhuǎn)化高產(chǎn)苯丙氨酸菌株E.coliATCC31884,獲得重 組菌命名為PH3 即ATCC31884-pTrc99a-tpl-trcp4m-t;rcglpX-tktA(即tpl和p4m基因分 別由一個(gè)trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，glpX和tktA基因由另外一個(gè)trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)）。
[0032] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是應(yīng)用所述大腸桿菌工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)苯酚。
[0033] 所述大腸桿菌工程菌株優(yōu)選：
[0034]PHI：ATCC31884-pTrc99a-tpl-p4m；
[0035]PH2 ：ATCC31884-pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX-tktA；
[0036]PH3 ：ATCC31884-pTrc99a-tpl-trcp4m-trcglpX-tktA；
[0037] 所述發(fā)酵生產(chǎn)苯酚涉及的培養(yǎng)基優(yōu)選：
[0038] 固體平板培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5,瓊脂15,pH7. 0,必要時(shí) 在培養(yǎng)基中添加Amp100yg/mL;
[0039] 發(fā)酵種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5,pH7.0,裝液量 10mL/20mL，必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加Amp100yg/mL;
[0040]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):甘油 10,Na2HP04 ? 12H2017. 11，KH2P043,NaCl0? 5,NH4C1 1， MgS04 ? 7H200. 492,CaCl2 ? 6H20 0. 022,裝液量 10mL/20mL，必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加Amp 100yg/mL；
[0041] (1)種子培養(yǎng)：從固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種至試管中培養(yǎng)，裝液量為 10mL/20mL，在培養(yǎng)基中添加Amp100yg/mL，37°C，200r/min培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0042] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按10% (v/v)的接種量，接