一種唐菖蒲伯克霍爾德菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及酶，特別涉及一種伯克霍爾德菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)是一類特殊的酯鍵水解酶，是具有多重催化功能的生物催 化劑，能催化底物的水解、酸解、醇解、氨解、轉(zhuǎn)酯以及酯化合成反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于食品工 業(yè)、造紙業(yè)、洗滌工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域以及相關(guān)的行業(yè)和領(lǐng)域中。
[0003] 脂肪酶催化反應(yīng)的機(jī)理與絲氨酸蛋白酶類似，由活性中心絲氨酸殘基上的羥基 對底物羰基C原子發(fā)起親核進(jìn)攻，形成四面體中間復(fù)合物，醇基從復(fù)合物上脫落后形成酰 基-酶復(fù)合體，它是脂肪酶不同催化反應(yīng)的關(guān)鍵中間體。在水相中，脂肪酶可催化各種油脂 的水解。而在有機(jī)相中，酶催化的有機(jī)反應(yīng)具有條件溫和、無環(huán)境污染、速率快、選擇性高等 優(yōu)點(diǎn)，脂肪酶可催化酯合成、轉(zhuǎn)酯等反應(yīng)。盡管非水相酶催化反應(yīng)具有以上優(yōu)點(diǎn)和催化后處 理方便等優(yōu)點(diǎn)，但脂肪酶的活性和穩(wěn)定性受傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑限制。尋找一種能在有機(jī)溶劑 中酶活性高和穩(wěn)定性好的脂肪酶就很有必要。
[0004] 脂肪酶在微生物界分布很廣，目前已發(fā)現(xiàn)假單孢菌、曲霉、青霉、微球菌等多種微 生物可產(chǎn)脂肪酶。據(jù)不完全統(tǒng)計，細(xì)菌有28個屬、放線菌4個屬、酵母菌10個屬、其它真菌 23個屬均能產(chǎn)脂肪酶。在各種來源的脂肪酶中，以細(xì)菌脂肪酶在有機(jī)相中催化的反應(yīng)類型 多、反應(yīng)活性及穩(wěn)定性最高，而伯克霍爾德菌屬（Burkholderiasp.)菌株產(chǎn)生的脂肪酶具 有良好的溫度穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、嚴(yán)格的對映體選擇性等諸多優(yōu)點(diǎn)，已引起學(xué)界及業(yè) 界的高度關(guān)注，包括Amano公司在內(nèi)的商業(yè)化生產(chǎn)公司已將其作為一種特殊行業(yè)脂肪酶制 劑予以開發(fā)，該酶在生物質(zhì)能源、有機(jī)合成、藥物手性拆分和工具酶等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分 廣闊。因此，提供一種高產(chǎn)脂肪酶的伯克霍爾德菌菌株及利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶的 方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能高產(chǎn)堿性脂肪酶的菌株及其制備堿性 脂肪酶的方法。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] -種高產(chǎn)堿性脂肪酶的微生物菌株，來源于腐敗洋蔥，該菌株的分類屬伯克氏 菌科（Burkholderiaceae)伯克霍爾德菌屬（Burkholderia)的唐菖蒲伯克霍爾德菌 (Burkholderiagladioli)，將其命名為BurkholderiagladioliBPS-1，已于2015年2 月 6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.10533。
[0008] 所述菌株BPS-1的形態(tài)學(xué)特征如下：革蘭氏陰性菌，菌落呈淡黃色，圓形，邊緣整 齊，光滑濕潤，生長兩天后產(chǎn)生黃色色素，專性好氧，細(xì)胞呈棒狀，富有運(yùn)動性，無芽孢，也不 產(chǎn)孢子，生長溫度為30-35°C，生長pH值為5. 0-8. 0,最適為pH值為6. 5-7. 5。
[0009] 所述菌株BPS-1采用16SrDNA的分子生物學(xué)和Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行 鑒定，結(jié)果如下：
[0010] 1.經(jīng)過對BPS-1的16SrDNA的序列比對，與Burkholderiagladioli的序列同源 性最高達(dá)到100%，具體DNA序列詳見序列表。
[0011] 2.Biolog鑒定為Burkholderiagladioli，SIM值（培養(yǎng) 24h)為0.575。
[0012] -種利用菌株BPS-1制備堿性脂肪酶的方法，包含以下制備步驟：
[0013] (1)種子培養(yǎng)：將保藏的BPS-1菌株經(jīng)活化后，接種于液體LB培養(yǎng)基中，30-35°C 培養(yǎng)12-18小時，得到種子培養(yǎng)液；
[0014] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按1-1. 5 % (V/V)的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 48-72小時后，8000r/mim離心10min，收集富含脂肪酶的發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基 成分為：糖蜜 0.5-1. 0% (V/V)、棕櫚油 0.25-0. 5% (V/V);氮源蛋白胨 1-1.5% (W/V)、 KH2P040 . 2-0 . 25% (W/V)、MgS04 ? 7H20 0. 05-0. 1% (W/V)。采用所述發(fā)酵培養(yǎng)基三角搖瓶 發(fā)酵72小時后，發(fā)酵液脂肪酶活力可達(dá)145. 67U/mL。
[0015] 酶活單位（U)定義：每分鐘分解pNPP產(chǎn)生1ymol對硝基苯酸所需的酶量定義為 一個酶活單位。
[0016] (3)分離純化：將上述發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀、陰離子交換層析及凝膠過濾層析三步 純化獲得電泳純的堿性脂肪酶。純化后的脂肪酶比活力達(dá)到443904. 8U/mg。
[0017] 本發(fā)明對脂肪酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。實驗結(jié)果證明該脂肪酶的最適反應(yīng)pH為 8. 5,最適反應(yīng)溫度為50°C，在pH8. 0-11. 0范圍內(nèi)都具有極高的穩(wěn)定性，對短鏈醇的耐受性 良好。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0019] (1)提供了一種來源于腐敗洋蔥的高產(chǎn)堿性脂肪酶的伯克霍爾德菌株BPS-1。該 菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定、原料來源廣泛、生產(chǎn)成本低廉。
[0020] (2)提供了一種利用菌株BPS-1發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶酶的方法。利用該方法制備 的堿性脂肪酶酶活力可達(dá)145. 67U/mL，在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性極好，并對短鏈醇具有良好的 耐受性，在生物質(zhì)能源、有機(jī)合成、藥物手性拆分和工具酶等領(lǐng)域具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛 力和廣泛的應(yīng)用前景。
[0021] (3)本發(fā)明所述利用菌株BPS-1發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶酶的方法，利用糖廠生產(chǎn)過 程中的主要副產(chǎn)品甘蔗糖蜜作為發(fā)酵原料，既能充分利用糖廠廢棄資源又能降低發(fā)酵產(chǎn)物 成本，同時糖蜜中還含有微生物生長繁殖所需的生物素及氮、磷、鉀等微量元素，有助于提 尚脂肪酶的廣量。
[0022] (4)本發(fā)明所述利用菌株BPS-1發(fā)酵生產(chǎn)堿性脂肪酶酶的方法，所選擇的復(fù)合碳 源棕櫚油作為一種廉價的食用油也極易獲得，而其氮源則只要是可作為氮源通化的含氮物 質(zhì)即可，該方法原料來源廉價且廣泛，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了便利條件。
【附圖說明】
[0023] 圖1:本發(fā)明制備的堿性脂肪酶的電泳圖
[0024] 圖2 :本發(fā)明制備的堿性脂肪酶最適反應(yīng)pH示意圖
[0025] 圖3 :本發(fā)明制備的堿性脂肪酶pH穩(wěn)定性示意圖
[0026] 圖4 :本發(fā)明制備的堿性脂肪酶最適反應(yīng)溫度示意圖
[0027] 圖5 :本發(fā)明制備的堿性脂肪酶溫度穩(wěn)定性示意圖
[0028] 圖6 :本發(fā)明制備的堿性脂肪酶對有機(jī)溶劑耐受性示意圖
[0029] 保藏信息
[0030] 唐菖蒲伯克霍爾德菌（BurkholderiagladioliBPS-1)，已于2015年2月6日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，保藏地址為北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 10533。
【具體實施方式】
[0031 ] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0032] 實施例1 :產(chǎn)堿性脂肪酶菌株的篩選及鑒定
[0033] 1、定向篩選平板的制備
[0034] 根據(jù)伯克霍爾德菌具有可利用特殊的代謝產(chǎn)物及對抗生素的抗藥性等特點(diǎn)，設(shè)計 改良的TB-T平板定向篩選，篩選伯克霍爾德菌陽性率可高達(dá)100%。詳細(xì)配方如下：1L改 良的TB-T定向篩選平板中含有葡萄糖2g、L-天冬酰胺0. 5g、NaHC030. 5g、KH2P040 . 25g、 MgS04 ? 7H20 0? 05g、臺酚藍(lán)0? 05g、四環(huán)素0?Olg、氨芐青霉素0? 15g、瓊脂粉15g。
[0035] 2、鑒定平板的制備
[0036] 1L的羅丹明B鑒定平板中含有蛋白胨5g、酵母提取物3g、NaCl8g、羅丹明B溶液 (0? 1 %，W/V) 4mL，豆油乳化液 10mL。
[0037] 所述豆油乳化液，配制方法如下：3mL豆油和9mL聚乙烯醇（2%，w/v)混合后用乳 化機(jī)乳化l〇min，放置5分鐘后，如有分層繼續(xù)乳化10min，直到完全不分層即可。
[0038] 3、產(chǎn)堿性脂肪酶菌株的篩選
[0039] 將腐敗的洋蔥剪碎后懸浮于適量的生理鹽水中，梯度稀釋至懸浮液的10 4_10 3 倍，涂布于改良的