一種混合前體耦合真菌誘導(dǎo)子高效合成納他霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種高效生產(chǎn)納他霉素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納他霉素是由納塔爾鏈霉菌flateJeasis)、褐黃孢 鏈霉菌（夕&印廣05?7口6'61友77[06770/'6'"61)、恰塔努加鏈霉菌（ 1%_/'6'/7廣05?7口6'61<^?<3^(3刀(90貧6'刀6 1_/61) 和利迪鏈霉菌（^SYrejOtopeesXn/ici/61)等經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種高效、廣譜的多稀大環(huán)內(nèi)酯類 抗生素。其分子式為C33H47NO13，化學(xué)結(jié)構(gòu)如式1所不，該分子含有一個二十六元環(huán)多稀大環(huán) 內(nèi)酯，環(huán)外通過糖苷鍵鏈接有一個海藻氨基糖。納他霉素與留醇化合物具有較高的親和性， 通過與細(xì)胞膜上的留醇化合物反應(yīng)，由此引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變而破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的 滲漏，使細(xì)胞死亡。納他霉素不僅抗真菌，而且還能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，可用于治療真菌 感染，包括假絲酵母、青霉、曲霉菌、鐮刀霉等。由于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上不存在這種甾 醇化合物，所以納他霉素對細(xì)菌沒有抑制作用。因其不抑制細(xì)菌發(fā)酵、安全無毒，所以在乳 制品、肉制品及果蔬等食品工業(yè)中也得到廣泛的應(yīng)用，被世界上30多個國家批準(zhǔn)為食品防 腐劑。
[0003] 式1納他霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 1955年，Struykd等人從南非Natal州的土壤樣品中分離出納塔爾鏈霉菌，并從中首次 分離得到了納他霉素，我國最早曾譯名為匹馬菌素、游霉素等。國外關(guān)于納他霉素發(fā)酵生產(chǎn) 方面的研究比較深入，相關(guān)的專利報道也比較多。而國內(nèi)對納他霉素的研究相對滯后，大多 側(cè)重于菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面，楊東靖等利用鏈霉菌抗性與紫外誘變相結(jié)合，獲 得納他霉素高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量達到2. 80g/L;朱惠等通過基因重排技術(shù)，獲得納他霉素產(chǎn)量可 達3. 52g/L的菌株；駱健美等通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化，使納他霉素產(chǎn)量達到5. 67g/L;同時 國內(nèi)一些其他的科研機構(gòu)也在做相關(guān)的研究。
[0004] 目前，納他霉素已在乳制品、飲料、水果、肉類等食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，已 經(jīng)商品化生產(chǎn)的納他霉素有美國Cyanamid公司的Myprozine，美國GB發(fā)酵工業(yè)公司 的Delvocid。此外，還有Natafucin、PimafuciruNatamaxvx等商品名稱。其中，霉克 OVate皿xTX；是納他霉素和乳糖按1 :1(質(zhì)量比）的比例混合而成，可用于食品表面防腐處 理或直接添加到食品中。但是，目前國內(nèi)納他霉素的發(fā)酵水平還比較低，導(dǎo)致成本太高，限 制了納他霉素作為一種新型的天然防腐劑在我國實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的技術(shù)目的為：針對目前納他霉素產(chǎn)量較低的現(xiàn)狀，提供一種操作簡單，且 能夠促進納塔爾鏈霉菌高效合成納他霉素的方法，該方法能顯著提高納他霉素的產(chǎn)量，降 低納他霉素的生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本。
[0006] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種高效合成納他霉素的 方法，包括納塔爾鏈霉菌flateJeasis)的發(fā)酵，其中，在發(fā)酵過程中以 流加的方式向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加納他霉素混合前體，在發(fā)酵過程中添加真菌誘導(dǎo)子，所 述的納他霉素混合前體選自丙酸鈉、乙酸鈉和異亮氨酸，所述的真菌誘導(dǎo)子為產(chǎn)黃青霉 {Penicillium chrysogemmf)抱發(fā)養(yǎng)叛。
[0007] 其中，所述的納他霉素混合前體在發(fā)酵過程的添加時間優(yōu)選在發(fā)酵的24h_36h 時，每隔兩小時添加一次。所述的真菌誘導(dǎo)子在發(fā)酵過程的添加時間優(yōu)選在發(fā)酵60h時。
[0008] 本發(fā)明中，所述的納他霉素混合前體由摩爾比為1 :1~15 :1~15的丙酸鈉、乙酸鈉 與異亮氨酸組成；其添加量優(yōu)選〇. 1~1. 〇%(V/V)，最優(yōu)選〇. 6%(V/V)。
[0009] 本發(fā)明中，所述的真菌誘導(dǎo)子為產(chǎn)黃青霉cArjsogefflM?)的發(fā)酵液， 優(yōu)選產(chǎn)黃青霉在發(fā)酵培養(yǎng)基中28~34°C搖床培養(yǎng)2~7d的發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每 1000 mL中含有葡萄糖20~30g，酵母膏l(xiāng)~5g，牛肉膏5~10g。該產(chǎn)黃青霉的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選 pH6. 8~7. 3。所述的真菌誘導(dǎo)子優(yōu)選發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后又離心所得的上清液。所述的上 清液優(yōu)選經(jīng)過微孔濾膜過濾除菌。所述的微孔濾膜的孔徑為〇. 2~1. 25ym，優(yōu)選0. 45ym。 所述的產(chǎn)黃青霉是任何產(chǎn)黃青霉菌屬的菌株。真菌誘導(dǎo)子的添加量優(yōu)選1~10%(V/V)，更優(yōu) 選 6%(V/V)。
[0010] 本發(fā)明中，所述的真菌誘導(dǎo)子的一較佳制備實例由以下方法制備而得： (1) 真菌的培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基上的產(chǎn)黃青霉接種于液 體種子培養(yǎng)基中，28~34°C、150~220r/min培養(yǎng)l~7d; 所述的斜面培養(yǎng)基配方為每1000 mL中含有：玉米淀粉50~100g，葡萄糖15~30g，瓊脂粉 15~20g; 所述的液體種子培養(yǎng)基配方為每1000 mL中含有：葡萄糖20~30g，酵母膏l(xiāng)~5g，牛肉膏 5~10g，滅菌后pH7. 0~7. 5 ; (2) 將步驟（1)培養(yǎng)好的發(fā)酵液先六層紗布過濾，然后8000~12000r/min離心，保留上 清液，最后用微孔濾膜過濾除菌種，即得真菌誘導(dǎo)子。
[0011] 本發(fā)明中，發(fā)酵中所采用納塔爾鏈霉菌種子是本領(lǐng)域常規(guī)，優(yōu)選的方法由包括 以下步驟制備：將斜面培養(yǎng)基上的納塔爾鏈霉菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，2 6 ~ 3 2 °C培 養(yǎng)2~7d;所述的斜面培養(yǎng)基為每1000 mL中含有：葡萄糖10~20g，麥芽浸膏l(xiāng)~5g，酵母膏 l~5g，胰蛋白胨5~15g，瓊脂粉15~20g;所述的液體種子培養(yǎng)基為每1000 mL中含有：葡萄糖 15~30g，蛋白胨5~15g，酵母膏5~10g，氯化鈉5~15g。其中，所述的斜面培養(yǎng)基和液體種子 培養(yǎng)基的pH為6. 5~8. 0,優(yōu)選pH7. 0~7. 5,最優(yōu)選pH7. 2。
[0012] 本發(fā)明中，所述的納塔爾鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基是常規(guī)的 納塔爾鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基，本發(fā)明優(yōu)選每1000 mL中含有葡萄糖10~20g，黃豆餅粉20~40g， 可溶性淀粉20~40g，酵母膏5~10g。本發(fā)酵培養(yǎng)基pH6. 5~8. 0,優(yōu)選pH7. 0~7. 5,最優(yōu)選pH7. 2。
[0013] 本發(fā)明中，納塔爾鏈霉菌的發(fā)酵是常規(guī)條件，優(yōu)選發(fā)酵溫度26~32°C，發(fā)酵時間 5~9d。發(fā)酵時優(yōu)選160~220r/min振蕩培養(yǎng)。
[0014] 本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基中納塔爾鏈霉菌的接種量是常規(guī)，優(yōu)選1~10%(V/V)。
[0015] 本發(fā)明中，所述的納塔爾鏈霉菌是常規(guī)的納塔爾鏈霉菌屬中的任何菌株。
[0016] 本發(fā)明中，所述的各種培養(yǎng)基的配制都是常規(guī)方法，將各種原料混合后用蒸餾水 定容即可。所述的培養(yǎng)基使用前都要經(jīng)過滅菌。需要調(diào)PH值的，定容后進行調(diào)節(jié)pH值。pH 值的調(diào)節(jié)方法是常規(guī)，用酸或堿調(diào)節(jié)。
[0017] 本發(fā)明中，所用的試驗材料除特別說明外，市場上均可售得。
[0018] 有益效果： 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加納他霉素混合前體和真菌誘導(dǎo)子， 大大提高了納他霉素的產(chǎn)量和純度，使納他霉素的產(chǎn)量達到5. 97g/L以上，比不添加混合 前體和真菌誘導(dǎo)子的產(chǎn)量相比提高了 573.1%。同時，合成方法本身工藝簡單、物料利用率 高，設(shè)備要求低，降低了生產(chǎn)成本，促進了其生產(chǎn)的工業(yè)化進程。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)的說明，以下實施例中未注明具體實 驗條件的，通常按常規(guī)條件或制造廠商建議的條件。
[0020] 本發(fā)明提供了一種混合前體耦合真菌誘導(dǎo)子促進納他霉素高效合成的方法，通過 向發(fā)酵液中流加納他霉素混合前體和真菌誘導(dǎo)子來提高納他霉素的產(chǎn)量。
[0021] 本發(fā)明中，所述的納塔爾鏈霉菌flateJeasis)購于中國科學(xué)院微 生物研究所菌種保藏中心，產(chǎn)黃青霉為本實驗室保藏菌種。
[0022] 實施例1 1、種子的制備：從納塔爾鏈霉菌斜面培養(yǎng)基上挑取2環(huán)孢子于無菌蒸餾水中，制成質(zhì) 量濃度為5%的孢子懸液，然后按8%(V/V)的接種量接種于含有40mL液體種子培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，30°C、180r/min搖床培養(yǎng)48h。
[0023] 所述的斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖12g，麥芽浸膏4g，酵母膏4g，胰蛋白胨7g，瓊脂 粉20g，加蒸餾水定容至1000mL，滅菌后pH7. 2。
[0024] 所述的液體種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，蛋白胨6g，酵母膏8g，氯化鈉8g，加水 定容至lOOOmL，滅菌后pH7. 3。
[0025] 2、真菌誘導(dǎo)子的制備：將斜面培養(yǎng)基上的產(chǎn)黃青霉用無菌蒸餾水制成質(zhì)量濃度為 5%的孢子懸液，并以5%(V/V)的接種量接種于含有40mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液六層紗布過濾，然后10000r/min離心 15min，保留上清液，最后用孔徑為0. 22ym的微孔濾膜過濾除菌，即得真菌誘導(dǎo)子。
[0026] 所述的斜面培養(yǎng)基配方為：每1000 mL中含有玉米淀粉80g，葡萄糖25g，瓊脂粉 20g〇
[0027] 所述的液體培養(yǎng)基配方為：每1000 mL中含有葡萄糖30g，酵母膏4g，牛肉膏8g，滅 菌后pH7. 2。
[0028]3、發(fā)酵培養(yǎng)時，將種子液按5% (V/V)的接種量接種于含有40mL納他霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基的250mL三角瓶中，30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵24h時，按照每隔兩小時添加一次的 方法，向發(fā)酵液中加入比例為0.6%(V/V)的混合前體（丙酸鈉：乙酸鈉：異亮氨酸=1:7:1)， 在發(fā)酵60h時按5%(V/V)的比例添加真菌誘導(dǎo)子。整個發(fā)酵過程共7天。
[0029] 所述的納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，黃豆餅粉30g，可溶性淀粉30g， 酵母膏8g，滅菌后pH7. 2。
[0030] 4、納他霉素產(chǎn)量的測定：取ImL納他霉素發(fā)酵液，加入9mL甲醇，充分振蕩后， 12000r/min離心lOmin，保留上清液，用HPLC法檢測納他霉素的產(chǎn)量達到5. 99g/L。
[0031] 實施例2 1、種子的制備：從納塔爾鏈霉菌斜面培養(yǎng)基上挑取2環(huán)孢子于無菌蒸餾水中，制成質(zhì) 量濃度為5%的孢子懸液，然后按8%(V/V)的接種量接種于含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，32 °C、200r/min搖床培養(yǎng)48h。
[0032] 所述的斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1