一種提高濃香型基酒中3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇的工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域具體涉及一種提高濃香型基酒中3-羥基-2- 丁酮和2， 3_ 丁二醇的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基-2- 丁酮又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，在自然界存在于玉米、葡萄、可可、蘋 果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于作為奶油、干 酪、咖啡、堅(jiān)果的香味增強(qiáng)劑。2, 3-丁二醇在自然界中存在于玉米、葡萄、蘋果等許多食品 中。3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇被認(rèn)為是白酒質(zhì)量的重要成分，在白酒中起著緩沖、平 衡的作用，能使酒產(chǎn)生優(yōu)良的酒香和綿甜的口味，同時(shí)白酒中3-羥基-2-丁酮和2, 3-丁二 醇是呈甜味物質(zhì)，并有助香作用，特別是在回味上使之有醇厚感，能使酒醇厚綿甜、有自然 感。
[0003] 當(dāng)前白酒消費(fèi)處于由香向味、高度向低度的發(fā)展趨勢(shì)下，它在保持濃香白酒風(fēng)格 的前提下，更加注重酒體的淡雅、綿甜與醇和，這就需要提高白酒中3-羥基-2-丁酮和 2, 3- 丁二醇的含量。目前大部分白酒的基酒中3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇含量較低， 3-羥基-2- 丁酮在10mg/L以下，平均在4mg/L左右，2, 3- 丁二醇在15mg/L以下，平均在 5mg/L左右；清香型白酒中3-羥基-2-丁酮和2, 3-丁二醇最少，有的白酒中這些物質(zhì)含量 為零。這主要是由于窖池內(nèi)酒醅中酸性大、氧氣含量少、底物（單糖、雙糖等）濃度小，眾多 微生物在一起生長(zhǎng)、代謝，它們之間又相互制約，使產(chǎn)3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇的解 淀粉芽孢桿菌等菌在窖池內(nèi)產(chǎn)量較小。而高檔酒如濃香型五糧液白酒中3-羥基-2- 丁酮 和2, 3- 丁二醇含量較高，3-羥基-2- 丁酮在40-70mg/L，2, 3- 丁二醇在30-50mg/L ;醬香 白酒中含量最高，茅臺(tái)酒3-羥基-2-丁酮在158mg/L，2,3-丁二醇在160mg/L，大部分白酒 基酒中這兩種物質(zhì)含量與它們相比有一定的差別，有必要提高基酒中3-羥基-2-丁酮和 2, 3-丁二醇含量。
[0004] 3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇是微生物糖代謝的中間代謝產(chǎn)物。以糖質(zhì)為原料 利用微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生3-羥基丁酮，但是目前有關(guān)微生物產(chǎn)生3-羥基-2- 丁酮的報(bào)道 很少。國(guó)內(nèi)山東大學(xué)利用一株克雷伯氏茵在以葡萄糖和磷酸氫二銨為主要成分的培養(yǎng)基中 發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇；山東省化工研究院應(yīng)用一株產(chǎn)酸克雷伯式菌發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇； R. M. Teixeira等報(bào)道漢遜酵母發(fā)酵產(chǎn)3-羥基丁酮，產(chǎn)量最高可達(dá)0. 36g/L。據(jù)目前國(guó)內(nèi)外 報(bào)道顯示，2, 3- 丁二醇生產(chǎn)菌種主要是克雷伯氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌，但這些菌屬于致病性菌 株，難以符合生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化安全生產(chǎn)的要求。經(jīng)安徽省科技情報(bào)研究所科技查新表明，未 見高產(chǎn)3-羥基，2- 丁酮、2, 3- 丁二醇的解淀粉芽孢桿菌在釀酒中用于提高基酒中3-羥基， 2_ 丁酮、2, 3- 丁二醇含量的應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種提高濃香型基酒中3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇含量 的方法，能夠解決濃香型白酒3-羥基-2- 丁酮和2, 3-丁二醇含量較低的問(wèn)題。
[0006]目前解淀粉芽孢桿菌等菌在窖池內(nèi)由于糖濃度、pH、氧氣、二氧化碳等因素的影響 導(dǎo)致其3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇產(chǎn)量很小，而它們?cè)谝后w培養(yǎng)基中通氣發(fā)酵產(chǎn)量是 窖池內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)量的幾十倍。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明把解淀粉芽孢桿菌在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn) 行液體通氣培養(yǎng)，所得發(fā)酵液中產(chǎn)物3-羥基-2- 丁酮達(dá)6000mg/L、2, 3- 丁二醇達(dá)30000mg/ L，把發(fā)酵液按一定比例通過(guò)潤(rùn)糧或?yàn)⑷氤龀鼐契ㄟ^(guò)蒸餾大幅提高基酒中3-羥基-2- 丁 酮、2, 3-丁二醇的含量，使酒體更加醇厚、綿甜，提高了酒的質(zhì)量。
[0007] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題，采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明首先公開了一種解淀粉芽孢桿菌，其保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)GJJNBL004,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號(hào)為CCTCC NO :M2014494,保藏日期為2014年10月19日；保藏地址為中國(guó).武 漢.武漢大學(xué)。菌株經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定， Bacillus amyloliquefaciens GJJNBL004 菌株的 26S rDNA 序列與其它多株 BaciIlus amyloliquefaciens.的 26S rDNA 序列有 99. 6% 的相似性。
[0009] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌是來(lái)源于安徽古井貢酒股份有限公司的窖泥中。該菌是 窖池體系內(nèi)的微生物，是生物安全菌種，不會(huì)給白酒產(chǎn)品帶來(lái)不良發(fā)酵產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)和生理化特征為：菌株呈桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性 菌，白色、半透明，菌落光滑濕潤(rùn)、稍隆起；菌株在溫度20°C -45°C內(nèi)、pH5. 0-10. 0內(nèi)都能正 常生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為35°C。
[0011] 本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌可用于提高濃香型基酒中3-羥基-2-丁酮和2, 3- 丁二 醇含量。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了提高濃香型基酒中3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇含量的方 法，其是對(duì)上述的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行菌種活化、種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；在由 出池酒醅和糧食混合后蒸餾獲得濃香型基酒時(shí)，先用所述發(fā)酵液浸潤(rùn)糧食原料，或?qū)l(fā)酵 液噴灑出池酒醅，然后再進(jìn)行蒸餾獲得濃香型基酒，即可提高濃香型基酒中3-羥基-2- 丁 酮和2, 3- 丁二醇含量；所述發(fā)酵液質(zhì)量為所述出池酒醅和所述糧食總質(zhì)量的5%~10%。 具體步驟為：
[0013] 步驟1、菌種活化
[0014] 將菌種活化培養(yǎng)基在121°C下滅菌20min，用接種環(huán)蘸取兩環(huán)解淀粉芽孢桿菌接 種到含10-15mL所述菌種活化培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，有氧條件下35°C活化培養(yǎng)24小時(shí)，獲得 活化菌種；
[0015] 所述菌種活化培養(yǎng)基的組分及其重量百分比為：蛋白胨1%、牛肉膏0. 5%、葡萄 糖3 %、氯化鈉0. 05 %、硫酸銨0. 09 %、硫酸鐵0. 01 %、硫酸鎂0. 03 %、CaCl2O. 5 %、酒醅浸 提液20%、瓊脂2%，余量為蒸餾水，pH7. 0 ;
[0016] 步驟2、種子液培養(yǎng)
[0017] 將種子培養(yǎng)基在121°C下滅菌20min，用接種環(huán)蘸取兩環(huán)活化菌種接種到含15mL 所述種子培養(yǎng)基的搖瓶中，35 °C、HOrpm搖床培養(yǎng)24h或35 °C靜態(tài)培養(yǎng)24h，獲得種子液；
[0018] 所述種子培養(yǎng)基的組分及其重量百分比為：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖 3 %、氯化鈉0. 05 %、硫酸銨0. 09 %、硫酸鐵0.0 I %、硫酸鎂0. 03 %、CaCl2O. 5 %、酒醅浸提 液20%、瓊脂2%，余量為蒸餾水，ρΗ7·0 ;
[0019] 步驟3、發(fā)酵培養(yǎng)
[0020] 按10 %的接種量，將種子液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，35°C、HOrpm搖 床培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；
[0021] 或按10%的接種量，將種子液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，35°C進(jìn)行通氣 攪拌培養(yǎng)72h，其中攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，通入無(wú)菌空氣的量為0. 5vvm ;
[0022] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量百分比為：以糖度為9° BX的糖化液為基準(zhǔn)，加 入蛋白胨l〇g/L、牛肉膏5g/L、硫酸鎂0· 3g/L，pH7. 0 ;
[0023] 步驟4、用于濃香型基酒生產(chǎn)
[0024] 在由出池酒醅和糧食原料混合后蒸餾獲得濃香型基酒時(shí)，先用所述發(fā)酵液浸潤(rùn)糧 食原料，和/或用發(fā)酵液噴灑所述出池酒醅，然后再進(jìn)行蒸餾后獲得濃香型基酒，即可提高 濃香型基酒中3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇含量；所述發(fā)酵液質(zhì)量為所述出池酒醅和所 述糧食總質(zhì)量的5%~10%。
[0025] 所述酒醅浸提液按如下方法制備獲得：取出池酒醅樣品20g，加蒸餾水250mL，在 超聲波清洗器上振蕩浸提20min后，過(guò)濾所得過(guò)濾液即為酒醅浸提液。
[0026] 所述糖化液按如下方法制備獲得：將玉米、高粱和大米按質(zhì)量比7:2:1混合構(gòu)成 原料組；在原料組中加入4倍質(zhì)量的水和占原料組質(zhì)量0. 2%的淀粉酶，加熱至120°C，然后 降溫至90°C并再次加入占原料組質(zhì)量0. 2%的淀粉酶，保溫Ih ;繼續(xù)降溫至60°C，加入占原 料組質(zhì)量1 %的糖化酶，保溫Ih ;降至室溫，此時(shí)所得糖化液的糖度約在9~10° BX，加水 調(diào)節(jié)糖度，獲得糖度為9 ° BX的糖化液。
[0027] 與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0028] 本發(fā)明從窖泥中分離出的解淀粉芽孢桿菌，在窖池體系外，通過(guò)改變?cè)摼甑纳?長(zhǎng)代謝條件，在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行液體通氣培養(yǎng)發(fā)酵，提高發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物3-羥基-2- 丁 酮和2, 3- 丁二醇的量，然后把發(fā)酵液按一定比例潤(rùn)糧或?yàn)⑷氤龀鼐契蠓岣吡嘶浦?3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇的含量，改善基酒風(fēng)味，使酒體更加醇厚、綿甜，提高了酒的 質(zhì)量。
[0029] 本發(fā)明獲得的高含量3-羥基-2- 丁酮、2, 3- 丁二醇的基酒，可將濃香型白酒中 3-羥基-2- 丁酮和2, 3- 丁二醇的含量提高到合適的量，改善白酒風(fēng)味，從而使酒體更加醇 厚、綿甜；本發(fā)明基酒也可作為調(diào)味酒使用。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施 例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0031] 實(shí)施例1小試發(fā)酵
[0032] 1、實(shí)驗(yàn)材料：
[0033] 菌種：從安徽古井貢酒股份有限公司窖泥中分離的解淀粉芽孢桿菌菌種 (Bacillus amyloliquefaciens)GJJNBL004 ；
[0034] 菌種活化培養(yǎng)基：蛋白胨I %、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化鈉 0.05%、硫酸銨 0. 09 %、硫酸鐵0.0 I