一種初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法，具體涉及一種基于 計(jì)算抗生素敏感值初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，化學(xué)肥料給環(huán)境帶來的負(fù)面影響越來越受到人們重視，而生物類制品因?yàn)?其環(huán)境友好性被認(rèn)為是其最佳的替代品或補(bǔ)充品。因此，功能微生物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究越 來越多，微生物肥料、微生物農(nóng)藥等的研究開發(fā)也成為了該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在大量的研究工作 中篩選獲得的各類功能微生物，細(xì)菌類占有重要的比例。細(xì)菌類微生物不僅具有強(qiáng)大的功 能，如促生、抗病、抗旱等，其生長速度快，培養(yǎng)條件要求低也是成為研究重點(diǎn)的原因。
[0003] 定殖能力對功能微生物的應(yīng)用潛力具有決定性作用，功能再強(qiáng)大的微生物如果不 能在應(yīng)用中具有良好的定殖能力，其在應(yīng)用中的可行性就會(huì)降低。對于在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng) 條件下分離、篩選所得的功能微生物，判斷它們在復(fù)雜的環(huán)境中的定殖能力是功能微生物 從研發(fā)走向應(yīng)用的必經(jīng)之路。因此，選擇一個(gè)簡便、準(zhǔn)確的方法判斷其在應(yīng)用環(huán)境中的生存 能力顯得尤為重要。
[0004] 土壤是農(nóng)業(yè)類功能微生物主要的定殖載體。目前，常規(guī)的檢測微生物在土壤中的 定殖能力的方法是采集土壤樣品，通過分析其中微生物的數(shù)量來判斷其定殖能力的大小。 這個(gè)方法準(zhǔn)確，但是操作卻很繁瑣、所需時(shí)間長，不僅包括采集樣品、分離計(jì)數(shù)和對應(yīng)菌株 的鑒定確認(rèn)等必經(jīng)程序，還包括微生物施入土壤的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、場地選擇、環(huán)境條件分析等其 它的配套設(shè)施投入和相關(guān)數(shù)據(jù)的分析檢測。因此，簡便、準(zhǔn)確的判斷功能微生物的定殖能 力的方法，不僅可以減少繁瑣的操作程序和功能微生物的研究開支，更能反向指導(dǎo)在研究 過程中篩選在應(yīng)用時(shí)可能具有高環(huán)境適應(yīng)潛力的菌株，縮短功能微生物從研發(fā)到應(yīng)用的時(shí) 間，對促進(jìn)生物制品在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用推廣、推進(jìn)生態(tài)環(huán)境良好健康發(fā)展具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于計(jì)算抗生素敏感值初步判斷微生物 在土壤中定殖能力的方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種判斷菌株在土壤中定殖能力的方 法，包括以下步驟：
[0007] (1)根據(jù)指定21種抗生素藥敏片對待測菌株的抑菌圈直徑對其進(jìn)行分級：直徑為 0 的為 I 級，0 < D < 1 為 II 級，1 < D < 2 為 III 級，2 < D < 3 為 IV 級，3 < D < 4 為 V 級，4 < D < 5為VI級，…，并統(tǒng)計(jì)該菌株在各個(gè)級別的數(shù)量；
[0008] (2)根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算待測菌株對抗生素的敏感值，計(jì)算公式為：抗生素敏感值 =1X1級范圍的數(shù)量+2XII級范圍的數(shù)量+…+NXN級范圍的數(shù)量；
[0009] (3)初步判斷菌株在土壤中定殖能力：若待測菌株對21種指定抗生素敏感值小于 85,即可判斷待測菌株在土壤中具有定殖能力。
[0010] 本發(fā)明通過抗生素對菌株的抑菌圈直徑分級和敏感值計(jì)算方法，來判斷菌株在土 壤中的定殖能力，并通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法測定和計(jì)算方法的可行性和可靠性。
[0011] 本發(fā)明對應(yīng)用于土壤的功能微生物的定殖潛力提出了新的評價(jià)方法，對農(nóng)業(yè)領(lǐng)域 生物肥料、生物農(nóng)藥等在應(yīng)用時(shí)篩選高環(huán)境適應(yīng)能力的菌株具有重要的指導(dǎo)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
[0013] 實(shí)施例1
[0014] 1、抗生素藥敏片在菌株平板上產(chǎn)生抑菌圈直徑的分級
[0015] 將供試1號~9號共計(jì)9株微生物菌株進(jìn)行平板涂布，菌株中5、6、7號3株菌為 放線菌，其余為細(xì)菌。將21種抗生素藥敏片（如表1所示）放于平板上，通過測定抑菌圈 直徑的大小檢測其抑制菌株生長的情況（如表2所示），每種抗生素3個(gè)重復(fù)，以不接菌的 空白培養(yǎng)基為對照。30°C培養(yǎng)24~48h后，抑菌圈直徑計(jì)算其平均值。
[0016] 表1-21種抗生素
[0017]
[0018]表2-9菌株對抗生素敏感性測試結(jié)果
[0019] 單位：cm
[0020]

[0021 ] 注：以上數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差
[0022] 根據(jù)抑菌圈直徑大小將其分級，抑菌圈為0的為I級，0 < D彡1為II級，1 < D < 2 為 III 級，2 < D < 3 為 IV 級，3 < D < 4 為 V 級，4 < D < 5 為 VI 級…
[0023] 統(tǒng)計(jì)各菌株在各級中的分布數(shù)量，結(jié)果如表3所示。
[0024] 表3各菌株抗分級統(tǒng)計(jì)結(jié)果
[0025]
[0026] 2、計(jì)算菌株對抗生素的敏感值
[0027] 各菌株對抗生素的敏感值計(jì)算公式：抗生素敏感值=1X1級范圍的數(shù)量+2XII 級范圍的數(shù)量+-+NXN級范圍的數(shù)量
[0028] 根據(jù)公式計(jì)算出9株細(xì)菌的抗生素敏感值如表3所示，由于抗生素敏感性越高則 認(rèn)為該菌的適應(yīng)性越低。表3中各菌株的敏感值排序?yàn)?>8>9>5>6>3>1>2 > 4,因此初步判斷供試的9株菌的定殖能力排序大小為4>2>1>3>6>5>9>8 > 7〇
[0029] 3、根據(jù)指定21種抗生素敏感值初步判斷菌株定殖能力的驗(yàn)證及判斷菌株在土壤 中具有定殖能力的敏感值的確定
[0030] 3. 1菌株定殖能力檢測方法的研究確定
[0031] 將待測菌株1號~9號菌進(jìn)行階梯式遞增濃度馴化其抗300 y g/mL利福平，以此 標(biāo)記菌株在土壤中的定殖能力，并以搖瓶發(fā)酵檢測其效果。
[0032] 實(shí)驗(yàn)方法為：將1號~9號菌的馴化菌分別標(biāo)記為1'號~9'號，并進(jìn) 行混合液體發(fā)酵。發(fā)酵組合共計(jì)CK、1R~9R號共計(jì)10個(gè)，接入的菌株分別包括 1+2+3+4+5+6+7+8+9 (CK 為對照），
[0033] 1' +2+3+4+5+6+7+8+9(lR)，
[0034] 1+2'+3+4+5+6+7+8+9(2R),
[0035] 1+2+3'+4+5+6+7+8+9(3R),
[0036] 1+2+3+4'+5+6+7+8+9(4R),
[0037] 1+2+3+4+5，+6+7+8+9(5R)，
[0038] 1+2+3+4+5+6'+7+8+9(6R),
[0039] 1+2+3+4+5+6+7'+8+9(7R),
[0040] 1+2+3+4+5+6+7+8'+9(8R),
[0041]1+2+3+4+5+6+7+8+Y (9R)，將10組發(fā)酵好的搖瓶菌液進(jìn)行含300 y g/mL利福平 培養(yǎng)基劃線分離確定馴化菌株在此條件下的生長能力。
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對照組合菌液CK在該平皿上無菌株生長，而1R~9R分別有純菌 落生長，根據(jù)其形態(tài)特征等方法進(jìn)行對比，長出菌株分別為1'~9'號。從而證明9株馴 化菌在眾多菌同時(shí)存在的情況下，可以在含300 y g/mL利福平培養(yǎng)基中單獨(dú)分離出，具有 排它性，可以將含300 y g/mL利福平的培養(yǎng)基作為馴化菌株的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。
[0043] 3. 2盆栽測定菌株在土壤中的定殖能力
[0044] 將供試土壤在121 °C高壓滅菌3小時(shí)，分別在各個(gè)盆中裝10kg滅菌土，將分別進(jìn)行 液體發(fā)酵的濃度為X10scfU/mL的1'號~9'號菌液與滅菌土壤進(jìn)行混合，以不接菌的 培養(yǎng)液為對照，栽培煙草植株，每個(gè)菌液處理5個(gè)重復(fù)。
[0045] 在煙草的整個(gè)生長期中，分別在種植后的第2天、25天、40天、65天采集各個(gè)處理 中的土壤樣品，利用含300 y g/mL利福平培養(yǎng)基用稀釋平板涂布法計(jì)數(shù)10個(gè)處理中的菌落 含量。
[0046] 由表4可知，采集的4次樣品中，1'號、2'號、3'號、4'號、5'號、6'號隨著時(shí) 間推移其菌落數(shù)量都有所增加，而7'號、8'號的菌落則在第2次已經(jīng)無檢出，并且第1次 檢測結(jié)果菌落數(shù)量8'號>7'號，9'號在第3次無菌落檢出。由檢測結(jié)果可知，在整個(gè)樣 品菌落分析所反應(yīng)出的各菌株的定殖能力從大到小都表現(xiàn)出了以下排序：4 > 2 > 1 > 3 > 6 > 5 > 9 > 8 > 7,這和之前分析所得各菌株的敏感值大小所反映出的各菌株的定殖能力 的排序一致。由此，充分驗(yàn)證了用抗生素對菌株的抑菌圈直徑分級方法和敏感值計(jì)算方法 判斷菌株在土壤中的定殖能力具有可行性。
[0047] 另外，從分析結(jié)果中可以得知，當(dāng)菌株抗生素敏感值為83時(shí)（9'號），其定殖能力 較敏感值為78(5'號）的菌株下降很多，并且其定殖時(shí)間僅為接入土壤后的25天，而當(dāng)菌 株抗生素敏感值為85時(shí)（8'號），菌株已無定殖能力。由此判斷，當(dāng)菌株抗生素敏感值小 于85時(shí)，菌株在土壤中有一定的定殖能力，而當(dāng)菌株抗生素敏感值大于85時(shí)，菌株在土壤 中無的定殖能力。
[0048] 表4各菌株4次采集樣品中在含300 y g/mL利福平培養(yǎng)基的菌落數(shù)量
[0049] 單位：個(gè)/g
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 根據(jù)指定21種抗生素藥敏片對待測菌株的抑菌圈直徑對其進(jìn)行分級：直徑為O的 為 I 級，O < D < 1 為 II 級，I < D < 2 為 III 級，2 < D < 3 為 IV 級，3 < D < 4 為 V 級，4 < D < 5為VI級，…，并統(tǒng)計(jì)該菌株在各個(gè)級別的數(shù)量； (2) 根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算待測菌株對抗生素的敏感值，計(jì)算公式為：抗生素敏感值= IXI級范圍的數(shù)量+2X11級范圍的數(shù)量+…+NXN級范圍的數(shù)量； (3) 判斷菌株在土壤中定殖能力：若待測菌株對21種指定抗生素敏感值小于85,即可 判斷待測菌株在土壤中具有定殖能力。
【專利摘要】一種初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法，包括以下步驟：(1)抗生素對菌株抑菌圈直徑的分級，并統(tǒng)計(jì)21種抗生素對各菌株的抑菌圈直徑在各級的數(shù)量；(2)抗生素敏感值的計(jì)算：抗生素敏感值＝1×I級范圍的數(shù)量+2×II級范圍的數(shù)量+…+N×N級范圍的數(shù)量；(3)初步判斷菌株在土壤中定殖能力：若待測菌株對21種指定抗生素敏感值小于85，即可判斷菌株在土壤中具有定殖能力。本發(fā)明利用菌株對抗生素的敏感分級方法和敏感值計(jì)算方法，從而初步判斷菌株在土壤中的定殖能力，并通過盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法具有可行性和可靠性。
【IPC分類】C12Q1/18
【公開號】CN105039494
【申請?zhí)枴緾N201510512469
【發(fā)明人】吳翔, 甘炳成, 彭衛(wèi)紅, 謝麗源, 譚昊, 陳影, 賈定洪, 黃忠乾, 譚偉, 唐杰, 何曉蘭, 姜鄰, 王波, 唐利民, 李小林, 周潔
【申請人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月19日