附著型慢病毒載體、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種附著型慢病毒載體，以及該附著型慢病毒載體的制備方法及應(yīng) 用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著對(duì)疾病分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深及生物技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為治療疾病的 一種新途徑，治療的疾病也從遺傳病擴(kuò)展到感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等。目前， 用于基因治療的載體系統(tǒng)可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類(lèi)。慢病毒載體是一種特殊 的逆轉(zhuǎn)錄病毒，與常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體相比，不僅能感染分裂期細(xì)胞，還能 感染非分裂期細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞等），并且具有容納大 片段外源性目的基因、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)（免疫反應(yīng)小、安全性好）等優(yōu)點(diǎn)。慢病毒載 體在基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景，已成為當(dāng)前基因治療載體研究的熱點(diǎn)。
[0003] 典型的慢病毒載體系統(tǒng)為HIV-載體系統(tǒng)，由包裝成分和載體成分兩部分組成。包 裝成分由HIV-1基因組除去包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列構(gòu)建，能夠反式提供 產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。 [0004] 從慢病毒載體誕生至今，其安全性、滴度及轉(zhuǎn)導(dǎo)能力等均有較大改進(jìn)。第一代慢病 毒載體系統(tǒng)以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表，由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝質(zhì) 粒是HIV-1前病毒基因組5'端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子取代，3'端LTR由SV40 polyA 序列取代。包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)表達(dá)gag和pol，另一個(gè)表達(dá)env。包膜 質(zhì)粒采用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G)替代原病毒的env基因。載體質(zhì)粒攜帶5' 端LTR和全部5'端非翻譯區(qū)域，另外還帶有rev應(yīng)答元件（RRE)。第二代慢病毒載體系統(tǒng) 在第一代的基礎(chǔ)上作出改進(jìn)，即在包裝質(zhì)粒中刪除HIV的所有輔助基因（如vif、vpr、vpu 和nef基因），在增加載體安全性的同時(shí)不影響病毒的滴度和感染能力。第三代慢病毒載體 系統(tǒng)采用四質(zhì)粒替代原有的三質(zhì)粒系統(tǒng)，改進(jìn)之處在于：1)將rev基因單獨(dú)放在一個(gè)包裝 質(zhì)粒上；2)增加兩個(gè)安全特性，一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，刪除U3區(qū)的3' LTR，使載 體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即存在所有病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA，二是采用異源 啟動(dòng)子序列替代tat基因，僅保留原始HIV-1基因組中的gag、pol和rev。因此，第三代慢 病毒載體系統(tǒng)更加安全、可靠。
[0005] 雖然慢病毒載體的安全性、滴度及轉(zhuǎn)導(dǎo)能力等均有所提高，但也存在以下問(wèn)題，即 現(xiàn)有載體必須整合到宿主細(xì)胞染色體上，而載體的隨機(jī)整合會(huì)引起插入突變或?qū)е罗D(zhuǎn)基因 的沉默，嚴(yán)重影響載體在基因治療中的應(yīng)用。公告號(hào)CN101532031B的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種 非整合慢病毒載體系統(tǒng)，由PLVTH載體、pHelper1. 0載體和pCMV-VSV-G載體共同轉(zhuǎn)染宿主 細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞中包裝獲得，其中pHelper1. 0載體為pCMV-dR8. 2dvpr載體中HIV整 合酶基因編碼的HIV整合酶第257~259位氨基酸由IKV突變?yōu)锳AH獲得，該載體系統(tǒng)能 夠克服隨機(jī)整合的缺點(diǎn)，但其持久穩(wěn)定表達(dá)時(shí)間較短，15天左右表達(dá)目的基因的細(xì)胞個(gè)數(shù) 較常規(guī)病毒減少70~80%。因此，構(gòu)建高效安全的慢病毒載體是基因治療中亟待解決的問(wèn) 題。
[0006] 核基質(zhì)附著區(qū)（matrix attachment region，MAR)是指經(jīng)限制酶消化后仍附著在 核基質(zhì)上的DNA序列，長(zhǎng)度為200~2000bp，具有典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（沒(méi)有同源序列），如富 含AT堿基對(duì)（> 70% )，含有幾個(gè)短的"共有序列"和拓樸異構(gòu)酶II結(jié)合位點(diǎn)。MAR序列在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用：1)提供順式作用元件，具有復(fù)制起始點(diǎn)和啟 動(dòng)子功能；2)避免表觀沉默，提高載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。然而，尚未有MAR序列用于介導(dǎo) 慢病毒載體附著存在的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種附著型慢病毒載體，一方面介導(dǎo)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中穩(wěn)定、高效、持久的表達(dá)，另一方面附著的、而非整合到靶細(xì)胞基因組中，安全性能好。
[0008] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種附著型慢病毒載體的制備方法。
[0009] 最后，本發(fā)明再提供一種附著型慢病毒載體的應(yīng)用。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0011] 附著型慢病毒載體，由pLRZM載體與包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得，所述pLRZM 載體為pLVX-IRES-ZsGreenl載體（圖譜見(jiàn)圖1)中土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件 (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)替換為 人源性MAR序列或其95%以上同源序列所得。土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件序列如SEQ ID NO. 2 所示，也即 pLVX-IRES-ZsGreenl 載體序列（Cat. Nos. 632187)中第 4126 ~4717 位 堿基；人源性獻(xiàn)1?序列為661^&1^登錄號(hào)為1183137.1序列（如3￡〇10勵(lì).3所示）中第 14~2161位堿基。
[0012] 所述宿主細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，包裝系統(tǒng)為pHelperl.O和pHelper2.0, pLRZM載 體在宿主細(xì)胞中包裝得到附著型慢病毒載體。
[0013] 上述附著型慢病毒載體的制備方法，步驟如下：
[0014] 1)分別采用PacI和Xmal雙酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreenl載體，回 收并連接，得到pLVX-IRES-ZsGreen2載體；
[0015] 2)以人外周血基因組DNA為模板，利用引物P1、P2擴(kuò)增人源性MAR序列得擴(kuò)增產(chǎn) 物A;
[0016] 3)分別采用PacI和Xmal雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物A及pLVX-IRES-ZsGreen2載體，回收并 連接，得到pLRZM載體；
[0017] 4)采用pLRZM載體、包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到含附著型慢病毒載體 的細(xì)胞培養(yǎng)液，分離、純化得到附著型慢病毒載體。
[0018] 步驟1)中人工合成序列A的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 步驟2)中引物P1、P2為：
[0020] P1 :5，-CCGTTAATTTATCGCCACGCACAAGATC-3，，
[0021] P2 :5 ' -CAACCCGGGCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTATCA-3'，
[0022] 下劃線處為酶切位點(diǎn)，其中P1含有PacI酶切位點(diǎn)，P2含有Xmal酶切位點(diǎn)。
[0023] 步驟2)中擴(kuò)增產(chǎn)物A的堿基序列與GenBank登錄號(hào)為M83137. 1的人源性MAR序 列一致（見(jiàn)SEQ ID NO. 3中第14~2161位堿基）。
[0024] 步驟4)中宿主細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，包裝系統(tǒng)為pHelperl. 0和pHelper2. 0。
[0025] 上述附著型慢病毒載體的應(yīng)用，具體為：將外源基因插入附著型慢病毒載體的多 克隆酶切位點(diǎn)中，與包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到插入有外源基因的附著型慢病毒載 體，再轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，即可。
[0026] 所述宿主細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，包裝系統(tǒng)為pHelperl. 0和pHelper2. 0。插入有外 源基因的附著型慢病毒載體在宿主細(xì)胞中包裝成病毒顆粒后即可用于轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞（如哺 乳動(dòng)物細(xì)胞）。
[0027] 具體的，附著型慢病毒載體的應(yīng)用，步驟如下：
[0028] 1)以人基因組DNA為模板，利用引物P3、P4擴(kuò)增miR-145序列得擴(kuò)增產(chǎn)物B ;
[0029] 2)分別采用Xhol和BamHI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物B及附著型慢病毒載體，回收并連接， 得到 pLRZM-miR145 載體；
[0030] 3)采用pLRZM-miR145載體、包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)后分離、純化得到 含miR-145序列的附著型慢病毒載體。
[0031] 步驟1)中所述引物P3、P4為：
[0032] P3 :5，-CCGCTCGAGGAATGGTTGGTTTAAATCCACCC-3，，
[0033] P4 :5 ' -CCGGGATCCCATGCCTGATGGTGTCCTG-3'，
[0034] 下劃線處為酶切位點(diǎn)，其中P3含有Xhol酶切位點(diǎn)，P4含有BamHI酶切位點(diǎn)。
[0035] 步驟1)中擴(kuò)增產(chǎn)物B的堿基序列與Genbank登錄號(hào)為GQ292874. 1的人miR-145 前體序列一致（見(jiàn)SEQ ID NO. 6中第1357~2001位堿基）。
[0036] 步驟3)中宿主細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，包裝系統(tǒng)為pHelperl. 0和pHelper2. 0。
[0037] 本發(fā)明的有益效果：
[0038] 本發(fā)明中pLRZM載體含有核基質(zhì)附著區(qū)序列，將該載體與包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染宿主 細(xì)胞后，即在宿主細(xì)胞中包裝獲得附著型慢病毒載體。該附著型慢病毒載體附著于宿主細(xì) 胞染色體上，而非整合到宿主細(xì)胞染色體中，并且能夠介導(dǎo)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn) 定、尚效、持久的表達(dá)，可用于基因治療，具有廣闊的市場(chǎng)如景。
【附圖說(shuō)明】