一種芹菜素在線二維復合液相提取純化方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種蔬菜中的成分的提取分離方法，特別涉及一種芹菜素在線二維復 合液相提取純化方法。
【背景技術】：
[0002] 伴隨著畜牧獸醫(yī)業(yè)的前進與發(fā)展，從某些方面來說，我們發(fā)現(xiàn)了更多的疾病，更多 的細菌與病毒，已有的細菌與病毒更是發(fā)生了很多變異。畜禽大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖加大了 動物患病的可能，增加了傳染病的發(fā)生，同時降低了動物對于一般病原體的抵抗力。為了對 抗病原體的侵襲，治療疾病，保證生產(chǎn)，減少利益損失，人們必須加大藥物的使用量和種類， 如抗生素類藥物。然而大量的使用抗生素類藥物也會帶來許多嚴峻問題，這些問題在當今 的生產(chǎn)生活中日益顯著。首先，是濫用抗生素藥物引起畜禽體內正常菌群紊亂，造成免疫力 低下，增加了二次感染和繼發(fā)感染發(fā)生的可能性，使治療效果越來越差，形成惡性循環(huán)。其 次，集約化養(yǎng)殖中大量的應用抗生素類的藥物也會造成藥物殘留的超標，會嚴重影響動物 性產(chǎn)品的進出口貿易，危害到人類的身體健康。
[0003] 因此，在畜牧獸醫(yī)產(chǎn)業(yè)中，我們應當采取相應的應對措施：一方面嚴格管理控制抗 生素的使用，另一方面，我們應尋找能代替抗生素的新型理想藥品。近年來，現(xiàn)代中獸醫(yī)學 飛速發(fā)展，現(xiàn)代的中獸醫(yī)藥有著優(yōu)質，高效，穩(wěn)定，安全，質量可靠，用藥方便等幾大特點。 因為，中藥多來自于天然植物，所以它具有著很多的天然屬性，例如，化學成分組合的合理 性，藥物的功效的整體性以及雙向性，并且毒副作用小，不容易導致病原微生物，病毒等產(chǎn) 生耐藥性，極少情況下在動物體內形成有害藥物殘留的優(yōu)點。作為一種中藥制劑，芹菜素， 有著無毒，溫和，無殘留等優(yōu)勢。如何將芹菜素類產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)和推廣應用，需要我們對 其進行深入研究，開發(fā)和創(chuàng)新。這樣，才能使芹菜素類產(chǎn)品在畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮無限潛能。
[0004] 芹菜素的研究概況：
[0005] 中醫(yī)認為芹菜，具有有平肝清熱，祛風利濕，除煩消腫，涼血止血，解毒宣肺，健胃 利血、清腸利便、潤肺止咳、降低血壓、健腦鎮(zhèn)靜的功效。
[0006] 近5年來，有很多有關于芹菜素的藥理作用方面的一些研究，經(jīng)過歸納與總結，主 要對以下幾個方面有藥理作用。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用和對皮質神經(jīng)元的保護作用； 有抗菌作用；對心血管有降壓作用和對動脈粥樣硬化的預防作用；對腫瘤有抑制腫瘤細胞 生長、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、侵襲和轉移和抗氧化作用；雌激素樣作用； 還有化療增敏作用、放療增敏作用、誘導分化、抗突變作用等。
[0007] 本發(fā)明建立了一套芹菜素的提取與純化方法和流程，為拓展芹菜素的應用范圍及 其藥理作用的研究提供了實驗基礎，為進一步開發(fā)與利用芹菜資源打下了堅實的基礎，芹 菜素的抗菌作用十分顯著，使得芹菜素在中國畜牧業(yè)上有著極大的發(fā)展?jié)摿Α?br>
【發(fā)明內容】
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[0008] 為了獲得單一的芹菜素成分，去除芹菜中的其他成分及雜質，本發(fā)明采用二維液 相色譜法對芹菜素粗體品進行分離純化。將分離純化后的芹菜素樣品通過高效液相色譜檢 測，證明本發(fā)明方法可以得到高純度的芹菜素，在純度，收率和成本上由于現(xiàn)有技術。
[0009] 為此，本發(fā)明提供一種從芹菜中提取分離芹菜素的方法，所述方法步驟如下：
[0010] 步驟1，取干燥的芹菜葉，用乙醇提取，提取液過濾，濃縮至干；
[0011] 步驟2,取步驟1的提取物與C4填料混合，加入甲醇，置40°C旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸 發(fā)除去甲醇，得到干燥粉末；
[0012] 步驟3,取步驟2得到的干燥粉末，裝填制備色譜柱，連入在線二維液相色譜分離 系統(tǒng)。
[0013] 其中的色譜分離條件如下：
[0014] 表1?主分離色譜條件
[0015]
[0019] 樣品在在線二維液相色譜分離系統(tǒng)中的流程如下：
[0020] 樣品通過定量環(huán)，在分離柱I中運用低壓梯度得到分離。在分離柱中洗脫液通過 捕獲柱時，由于捕獲柱中水的加入使其極性增加，主分離柱中的餾分被富集在18根捕獲柱 中。被捕獲的餾分通過分離柱II使達到二次分離，整個分離過程結束。
[0021] 芹菜提取物經(jīng)在線二維色譜分離后，收集的19號餾分經(jīng)高效液相色譜色譜柱檢 測結果制備的芹菜素含量達95%以上。
[0022] 本發(fā)明優(yōu)選的方法如下：
[0023] 步驟如下：
[0024] 步驟1，稱取香芹葉粉末8-128，加入到400-6001111錐形瓶中，加入90-98%乙醇溶 液80-120ml，將錐形瓶放入超聲波清洗機中，設定超聲功率240-260W，溫度60-70°C提取 0. 5-lh;用孔徑0. 4-0. 5ym微孔濾膜過濾，將提取液和濾渣分離，濾渣加入90-98%乙醇溶 液60-80ml，超聲提取0. 5-lh，用孔徑0. 4-0. 5ym微孔濾膜過濾，將提取液和濾渣分離，濾 渣加入90-98%乙醇溶液60-80ml，超聲提取0. 5-lh，用孔徑0. 4-0. 5ym微孔濾膜過濾，將 提取液和濾渣分離，將3次提取液合并，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，得到香芹粗提樣品；
[0025] 步驟2.粗提芹菜素在線二維液相色譜的分離
[0026] 稱取0. 3-0. 5g香序粗提樣品，與1-1. 5gC4混合至旋轉蒸發(fā)瓶中，
[0027] 加入10_20mL甲醇，超聲使其溶解完全，置40-50°C旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸發(fā)除去甲 醇，得到干燥的均勻粉末狀混合物，將樣品裝柱，然后將該柱連入在線二維液相色譜分離系 統(tǒng)管路，分離條件如下：
[0028] 表1?主分離色譜條件
[0029]
[0030] 表2?二步分離色譜條件
[0031]
[0032] 樣品通過進樣柱，在分離柱I中運用低壓梯度分離，分離柱中的餾分被富集在18 根捕獲柱中，被捕獲的餾分通過分離柱II達到二次分離，單一化合物的洗脫液由餾份收集 器上的微孔板收集，收集的19號餾分為芹菜素。
[0033] 名詞術語的解釋：
[0034] 序菜素：分子式：C15H1()05;分子量：270. 25;屬于黃酮類化合物：化學結構為4, 5, 7 一三羥黃酮，其4, 5, 7位置的3個羥基和C2C3雙鍵決定了其獨特的藥理學特性。芹菜素是 一種黃色的結晶體，熔點為347~348°C、難溶于水，但是易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚等有 機溶劑，因其分子中含有酚羥基，故顯酸性，可以溶于堿性水溶液中。
[0035] 在線二維液相色譜分離系統(tǒng)：模式圖見圖20,該系統(tǒng)為現(xiàn)有技術，可以從市場上 購買得到，如德國色譜公司生產(chǎn)的250型號的二維分離系統(tǒng)。
[0036]C4:為一種分離色譜柱所用的填料
[0037] 本發(fā)明的篩選過程如下：
[0038] 實驗方法
[0039] 1.芹菜素標準溶液的制備
[0040] 稱取芹菜素標準品5mg，用甲醇定容于10ml容量瓶中，搖勻備用。
[0041] 2.香序粗提樣品溶液的制備
[0042] 2. 1新鮮香芹洗凈后，將根莖葉分開，剪碎，在干燥烘干箱中65°C完全干燥，分裝。
[0043] 2. 2準確稱取香芹葉粉末10. 0g，加入到500ml錐形瓶中，加入95 %乙醇溶液 100ml，將錐形瓶放入超聲波清洗機中，設定超聲功率250W，溫度65°C提取0. 5h。
[0044] 2. 3用孔徑0. 45ym微孔濾膜過濾，將提取液和濾渣分離，濾渣加入95 %乙醇溶液 70ml,超聲提取0. 5h。
[0045] 2. 4重復步驟2. 32次。
[0046] 2. 5將3次提取液合并，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，用一定體積甲醇溶解，備用。
[0047] 3.紫外最適吸收波長的選取
[0048] 使用NanoDrop2000核酸蛋白檢測儀的UV-VIS程序，檢測粗提芹菜素最適吸收波 長，選取經(jīng)過濾的30%乙醇作為基點調零。
[0049] 使用核酸蛋白檢測儀的UV-VIS程序從200-800nm范圍內自動掃描0. 0、0. 3、0. 6、 0. 9、1. 2、1. 5、1. 8ml標液，確定芹菜素最適吸收波長。
[0050] 4.粗提芹菜素在線二維液相色譜的分離
[0051] 4. 1上樣樣品的準備
[0052] 稱取0.4g香芹粗提樣品與1. 2gC4混合至旋轉蒸發(fā)瓶中，加入約15mL甲醇，超聲 使其溶解完全，置40°C旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸發(fā)除去甲醇，得到干燥的均勻粉末狀混合物。依 照進樣柱裝填方法將樣品裝柱，然后將該柱連入在線二維液相色譜分離系統(tǒng)管路。
[0053] 4. 2樣品在二維液相色譜柱中的流程
[0054] 樣品（固體）通過進樣柱，在分離柱I中運用低壓梯度得到分離。在分離柱中洗 脫液通過捕獲柱時，由于捕獲柱中水的加入使其極性增加，主分離柱中的餾分被富集在18 根捕獲柱中。被捕獲的餾分通過分離柱II使達到二次分離，整個分離過程結束。單一化合 物的洗脫液由餾份收集器上的微孔板得到收集，可以進一步地得到分析。
[0055] 通過選取不同的流動相體系，改變主分離流動相條件等因素，可以得到不同的主 分離色譜圖，通過尋找最佳條件，將主分離圖上各峰分開，進而建立芹菜素樣品的最佳二維 液相分離方法。
[0056] 4. 3餾分收集
[0057]自動收集各餾分，將各個餾分別置于離心管中，標記好后放置于冰箱4°C保存。
[0058] 5?高效液相色譜檢測
[0059] 5.1樣品的準備
[0060] 5. 2. 1取10mg芹菜素標準品溶于少量甲醇中，置于25mL容量瓶中，甲醇定容搖勻， 0. 22um有機H旲過濾后備用；
[0061] 5. 2. 2分別取4. 3收集的各個樣品分離餾分經(jīng)0. 22um有機膜過濾備用，
[0062] 5. 2檢測用色譜條件
[0063] 色譜柱：C18;柱溫：室溫；流動相：甲醇0. 4%，磷酸水溶液（1 :1);流速：0. 8ml/ min;檢測波長：346nm.將5. 1制備的樣品用高效液相色譜儀檢測。
[0064] 6?芹菜素含量的測定
[0065] 芹菜素含量的測定采用高效液相色譜法。準確稱取52. 6mg的芹菜素對照品溶解 于適量甲醇中，并準確定容于1001^作為母液，然后分別取0.25、0.5、1、2、3、511^于6個 10mL的容量瓶中，并用甲醇定容，作為不同濃度的標準液，取上述標準液過0. 45ym的濾膜 后，用色譜進行測定，色譜柱為C18柱（4. 6x250mm，5ym)，流動相為甲醇0. 4%，磷酸水溶 液（1:1)，流速〇. 8mL/min，檢測波長為346nm，進樣量為10yL。以色譜峰面積為縱坐標，芹 菜素對照品濃度為橫坐標，得線性回歸方程Y= 33783X-43787,R2 = 0. 9991，可知芹菜素 在0. 013-0. 26mg/mL范圍內峰面積與濃度呈良好的線性。
[0066]關系。
[0067] 7結果與分析
[0068] 7. 1紫外最適吸收波長的選取
[0069]由圖1可知，從800-200nm范圍內自動掃描，芹菜素標準品在200-800nm全波長 掃描的圖譜中顯示，芹菜素在200nm、270nm和346nm條件下有吸收峰的存在。而且2個波 長下的峰形都較規(guī)則，都有利于檢測波長的選擇，但在346nm條件下，有較高的吸收值，干 擾少，峰型更加規(guī)則和穩(wěn)定，有利于芹菜素液相條件下的檢測。故選擇346nm作為紫外檢測 用波長。
[0070] 圖1紫外全波長掃描圖
[0071] 7. 2二維液