[0131] (1)取步驟一中存放臨床樣本拭子的生理鹽水140 μ 1于I. 5ml離心管中；
[0132] ⑵加入 56〇 μ 1 含有 Carrier RNA混合液的 Buffer AVL (即 5· 6 μ I Carrier RNA 混合液+560 μ I Buffer AVL于離心管中，輕微漩禍15s ;
[0133] (3)瞬時(shí)離心完成后，室溫（15-25°C )放置10_20min，以保證Buffer AVL在離心 管中有充足的時(shí)間進(jìn)行裂解；
[0134] (4)加入560 μ 1乙醇（96-100 %，體積百分含量）于離心管中，漩渦混勻15s，離 心；
[0135] (5)取630 μ 1樣本溶液于吸附柱中，放置2min，使其與吸附柱充分接觸，8000rpm， 離心lmin，換干凈收集管；
[0136] (6)若樣本溶液多于630 μ 1，則重復(fù)上一步；
[0137] (7)在吸附柱中加入500 μ 1的AWl洗液，放置2min，使其與吸附柱充分接觸， 8000rpm離心lmin，換干凈收集管；
[0138] (8)在吸附柱中加入500 μ 1的AW2洗液，放置2min，使其與吸附柱充分接觸， 12000rpm離心3min，換干凈收集管；
[0139] (9)在吸附柱中加入300 μ 1的AW2洗液，放置2min，使其與吸附柱充分接觸， 12000rpm離心3min，換干凈收集管；
[0140] (10)將吸附柱蓋子打開(kāi)放置2min，使其內(nèi)外壓強(qiáng)一致，8000rpm空離lmin?？针x 結(jié)束以后，重復(fù)此步驟一次。
[0141] (11)空離結(jié)束后，將吸附柱轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，打開(kāi)吸附柱蓋，放置 20-30min，使乙醇揮發(fā)完全；
[0142] (12)加入50 μ I Buffer AVE洗脫核酸，8000rpm離心lmin，離心完成以后，將洗脫 下的核酸吸回吸附柱，離心Imin后丟掉吸附柱。
[0143] 二、實(shí)際臨床樣品的檢測(cè)
[0144] 1、反應(yīng)體系配制
[0145] 取15 μ 1恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液（見(jiàn)實(shí)施例1步驟一 1)、10 μ 1恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液（見(jiàn)實(shí) 施例1步驟一 2)、25 μ 1步驟二提取得到的臨床樣本溶液混合成50 μ 1反應(yīng)溶液，旋渦震蕩 均勻后注入裝載有引物對(duì)和單鏈DNA探針的24反應(yīng)腔碟式芯片（見(jiàn)實(shí)施例1步驟一 3)，貝占 封口膜后迅速離心30s。
[0146] 2、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)與檢測(cè)
[0147] 將碟式芯片置于博奧Isochip-RT恒溫?cái)U(kuò)增儀中，設(shè)置41°C反應(yīng)1小時(shí)，并同時(shí)完 成實(shí)時(shí)熒光掃描。并按照實(shí)施例1步驟二3的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。
[0148] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置常規(guī)RT-PCR方法用于本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果的可靠性驗(yàn)證。用于 檢測(cè)各呼吸道病毒的特異性RT-PCR引物序列如表1所示。
[0149] 表1用于檢測(cè)16種呼吸道病毒的特異性RT-PCR引物序列

[0152] 四、結(jié)果
[0153] 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示，針對(duì)每一種呼吸道病毒，采用RT-PCR方法檢測(cè) 陽(yáng)性的樣本例采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)均顯示陽(yáng)性結(jié)果。另外，對(duì)于少數(shù)樣本例而言，采用 RT-PCR法檢測(cè)陰性，但采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。通過(guò)對(duì)這些樣本例進(jìn)行后期重 新采樣RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些樣本例確實(shí)檢測(cè)為相應(yīng)呼吸道病毒陽(yáng)性。以上表明，本發(fā)明 試劑盒對(duì)相應(yīng)呼吸道病毒的檢出率高于RT-PCR法，且其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明試劑盒 和RT-PCR法檢測(cè)呼吸道常見(jiàn)病毒臨床樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果參見(jiàn)表2。
[0154] 表2本發(fā)明試劑盒和RT-PCR法檢測(cè)呼吸道常見(jiàn)病毒臨床樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)呼吸道病毒的引物對(duì)組，由如下16個(gè)引物對(duì)組成： 由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)1 ; 由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)2 ; 由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)3 ; 由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)4 ; 由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)5 ; 由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)6 ; 由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)7 ; 由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)8 ; 由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)9 ; 由序列表中序列19和序列20所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)10 ; 由序列表中序列21和序列22所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)11 ; 由序列表中序列23和序列24所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)12 ; 由序列表中序列25和序列26所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)13 ; 由序列表中序列27和序列28所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)14 ; 由序列表中序列29和序列30所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)15 ; 由序列表中序列31和序列32所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)16。2. 用于檢測(cè)呼吸道病毒的成套單鏈DNA，由探針組和權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組組 成； 所述探針組由如下16個(gè)單鏈DNA探針組成：序列表中序列33所示的單鏈DNA探針1 ; 序列表中序列34所示的單鏈DNA探針2 ;序列表中序列35所示的單鏈DNA探針3 ;序列表 中序列36所示的單鏈DNA探針4 ;序列表中序列37所示的單鏈DNA探針5 ;序列表中序列 38所示的單鏈DNA探針6 ;序列表中序列39所示的單鏈DNA探針7 ;序列表中序列40所示 的單鏈DNA探針8 ;序列表中序列41所示的單鏈DNA探針9 ;序列表中序列42所示的單鏈 DNA探針10 ;序列表中序列43所不的單鏈DNA探針11 ;序列表中序列44所不的單鏈DNA 探針12 ;序列表中序列45所示的單鏈DNA探針13 ;序列表中序列46所示的單鏈DNA探針 14 ;序列表中序列47所示的單鏈DNA探針15 ;序列表中序列48所示的單鏈DNA探針16。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的成套單鏈DNA，其特征在于：所述探針組中的每條單鏈DNA探 針的5'端均標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。4. 用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒，含有權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組或權(quán)利要求2或3 所述的成套單鏈DNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和內(nèi) 對(duì)照探針；所述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)由序列表中序列49和序列50所示的兩條單鏈DNA分子組成； 所述內(nèi)對(duì)照探針為序列表中序列51所示的單鏈DNA探針； 具體的，所述內(nèi)對(duì)照探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) TAMRA06. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有恒溫?cái)U(kuò)增緩 沖液和恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液； 所述恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%體積百分含量 DMS0，1M 山梨醇， 20mM四甲基氯化銨； 所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶IU/ y 1，T7RNA聚合 酶5U/ y 1，核糖核酸酶H 0? 5U/ y 1，焦磷酸酶0? 5U/ y I，RNA酶抑制劑5U/ y I，BSA 0? 5 y g/ y 1〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有碟式芯 片； 所述碟式芯片的1#至18#反應(yīng)腔分別存放干燥的如下（1)-(18): (1) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)1和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針1 ; (2) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)2和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針2 ; (3) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)3和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針3 ; (4) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)4和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針4 ; (5) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)5和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針5 ; (6) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)6和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針6 ; (7) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)7和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針7 ; (8) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)8和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針8 ; (9) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)9和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針9 ; (10) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)10和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針10 ; (11) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)11和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針11 ; (12) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)12和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針12 ; (13) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)13和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針13 ; (14) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)14和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針14 ; (15) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)15和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針15 ; (16) 權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)16和權(quán)利要求2中所述的單鏈DNA探針16 ; (17) 權(quán)利要求5中所述的內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和所述的內(nèi)對(duì)照探針； (18) 陰性對(duì)照品。8. 權(quán)利要求1-7中任一所述的引物對(duì)組或成套單鏈DNA或試劑盒在檢測(cè)或輔助檢測(cè)呼 吸道病毒中的非診斷目的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用中，將15 y 1所述恒溫?cái)U(kuò)增緩沖 液和10 y 1所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與25 y 1待測(cè)樣本溶液混合后注射入所述碟式芯片中， 41 °C下恒溫反應(yīng)Ih。10. 根據(jù)1-9中任一所述的引物對(duì)組或成套單鏈DNA或試劑盒或應(yīng)用，其特征在于：所 述呼吸道病毒為如下中的至少一種：甲型流感病毒、甲型流感病毒Hl亞型、甲型流感病毒 H3亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II 型、副流感病毒III型、冠狀病毒HKU1/OC43、冠狀病毒229E/NL63、人偏肺病毒、腸道病毒、 腸道病毒EV71型和腸道病毒CA16型。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的試劑盒中含有用于檢測(cè)呼吸道病毒的引物對(duì)組，由16個(gè)引物對(duì)組成，其序列為序列表中序列1-32。本發(fā)明提供的試劑盒支持高通量，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒感染，對(duì)于臨床而言，能夠在1小時(shí)內(nèi)獲得16種病毒指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果不僅快于目前較為普遍采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，而且對(duì)于快速輔助指導(dǎo)治療和用藥也具有重要意義。同時(shí)，多指標(biāo)的檢測(cè)也可以用于地域性的流行病學(xué)調(diào)研和疫情監(jiān)控，以研究呼吸道病毒感染在中國(guó)的流行情況。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105018648
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510468571
【發(fā)明人】張巖, 蓋偉, 邢婉麗, 宋翠丹, 程京
【申請(qǐng)人】博奧生物集團(tuán)有限公司, 清華大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月3日