rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%體積百分含量 DMSO, IM 山梨 醇，20mM四甲基氯化銨。
[0021 ] 所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶IU/ μ I，T7RNA 聚合酶5U/ μ 1，核糖核酸酶H 0. 5U/ μ 1，焦磷酸酶0. 5U/ μ 1，RNA酶抑制劑5U/ μ 1，BSA 0. 5 μ g/ μ I 〇
[0022] 所述試劑盒中還可含有碟式芯片，如24反應(yīng)腔碟式芯片。
[0023] 在本發(fā)明中，所述24反應(yīng)腔碟式芯片為博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的"晶芯 RTisochipTM-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀"的配套碟式芯片，其型號(hào)為I X 24。
[0024] 所述碟式芯片的1#至18#反應(yīng)腔分別存放干燥的如下（1)-(18):
[0025] (1)所述引物對(duì)1和所述單鏈DNA探針1 ; (2)所述引物對(duì)2和所述單鏈DNA探針 2 ; (3)所述引物對(duì)3和所述單鏈DNA探針3 ; (4)所述引物對(duì)4和所述單鏈DNA探針4 ; (5) 所述引物對(duì)5和所述單鏈DNA探針5 ; (6)所述引物對(duì)6和所述單鏈DNA探針6 ; (7)所述引 物對(duì)7和所述單鏈DNA探針7 ; (8)所述引物對(duì)8和所述單鏈DNA探針8 ; (9)所述引物對(duì)9 和所述單鏈DNA探針9 ; (10)所述引物對(duì)10和所述單鏈DNA探針10 ; (11)所述引物對(duì)11 和所述單鏈DNA探針11 ; (12)所述引物對(duì)12和所述單鏈DNA探針12 ; (13)所述引物對(duì)13 和所述單鏈DNA探針13 ; (14)所述引物對(duì)14和所述單鏈DNA探針14 ; (15)所述引物對(duì)15 和所述單鏈DNA探針15 ; (16)所述引物對(duì)16和所述單鏈DNA探針16 ; (17)所述內(nèi)對(duì)照引 物對(duì)和所述內(nèi)對(duì)照探針；（18)陰性對(duì)照品。
[0026] 所述陰性對(duì)照品具體可為無 RNA酶的水（Rnase-free水）。
[0027] 其中，將引物和探針包埋入碟式芯片的方法為：將引物、與所述引物相對(duì)應(yīng)的探 針、瓊脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探針和所述瓊脂糖在所述混合溶液中 的終濃度分別為0. 2 μΜ、50ηΜ、0. 1% (質(zhì)量百分含量）；取1 μ 1所述混合溶液點(diǎn)入相應(yīng)的 碟式芯片反應(yīng)腔，于潔凈超凈臺(tái)內(nèi)晾干后，壓片封裝，沖壓抽真空后制成。
[0028] 所述引物對(duì)組或成套單鏈DNA或試劑盒在檢測(cè)或輔助檢測(cè)呼吸道病毒中的非診 斷目的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 在所述應(yīng)用中，將15 μ 1所述恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液和10 μ 1所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與 25 μ 1待測(cè)樣本溶液混合后注射入所述碟式芯片中，41°C下恒溫反應(yīng)lh。
[0030] 在所述應(yīng)用中，可以鼻咽拭子作為待測(cè)樣本；相應(yīng)的，所述待測(cè)樣本溶液可為從鼻 咽拭子中提取的RNA。
[0031] 在本發(fā)明中，所述呼吸道病毒具體可為如下中的至少一種：甲型流感病毒、甲型流 感病毒Hl亞型、甲型流感病毒H3亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副 流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、冠狀病毒HKU1/0C43、冠狀病毒229E/ NL63、人偏肺病毒、腸道病毒、腸道病毒EV71型和腸道病毒CA16型。
[0032] 本發(fā)明提供的試劑盒支持高通量，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)常見呼吸道病毒感染，對(duì)于 臨床而言，能夠在1小時(shí)內(nèi)獲得16種病毒指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果不僅快于目前較為普遍采用的實(shí) 時(shí)熒光定量PCR方法，而且對(duì)于快速輔助指導(dǎo)治療和用藥也具有重要意義。同時(shí)，多指標(biāo)的 檢測(cè)也可以用于地域性的流行病學(xué)調(diào)研和疫情監(jiān)控，以研究呼吸道病毒感染在中國的流行 情況。
【附圖說明】
[0033] 圖1為碟式芯片及引物點(diǎn)樣腔示意圖。
[0034] 圖2為16種呼吸道病毒參考品碟式芯片檢測(cè)結(jié)果圖。其中，A為含有甲型流感病 毒MP靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-InfA在1#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；B為含有甲型流感病毒Hl 亞型靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-InfA_Hl在2#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；C為含有甲型流感病毒 H3亞型靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-InfA_H3在3#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；D為含有乙型流感病 毒MP靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-InfB在4#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；E為含有呼吸道合胞病毒 靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒PUC19-RSV在5#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；F為含有鼻病毒靶標(biāo)基因的重組 質(zhì)粒PUC19-HRV在6#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；G為含有腺病毒靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-ADV 在7#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；H為含有副流感病毒I型靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-PIVl在8# 反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；I為含有副流感病毒II型靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒PUC19-PIV2在9#反應(yīng) 腔的檢測(cè)結(jié)果J為含有副流感病毒III型靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒PUC19-PIV3在10#反應(yīng)腔 的檢測(cè)結(jié)果；K為含有冠狀病毒HKU1/0C43靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-Corn_0C在11#反 應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；L為含有冠狀病毒229E/NL63靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-Corn_NL在12# 反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；M為含有人偏肺病毒靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-hMPV在13#反應(yīng)腔的 檢測(cè)結(jié)果；N為含有腸道病毒靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-Entv在14#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；0 為含有腸道病毒EV71靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-EV71在15#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果；P為含 有腸道病毒CA16靶標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pUC19-CA16在16#反應(yīng)腔的檢測(cè)結(jié)果。A-P中，El 表示模板為IO1拷貝/ μ 1，以此類推，E5表示模板為10 5拷貝/ μ I ;NC表示陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 實(shí)施例1、用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒的制備及其使用
[0038] -、用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒的制備
[0039] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)呼吸道病毒的試劑盒組成如下：
[0040] 1、恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液
[0041] 恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：200mM Tris-HCUpH 8.0)，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%體積百分含量 DMS0，1M 山梨醇， 20mM四甲基氯化銨。
[0042] 2、恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液
[0043] 恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶IU/ μ I，T7RNA聚合 酶5U/ μ 1，核糖核酸酶H 0· 5U/ μ 1，焦磷酸酶0· 5U/ μ I，RNA酶抑制劑5U/ μ I，BSA 0· 5 μ g/ μ I。
[0044] 3、裝載有引物對(duì)和單鏈DNA探針的24反應(yīng)腔碟式芯片
[0045] 所述24反應(yīng)腔碟式芯片為博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的"晶芯RTisochipTM-A恒 溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀"的配套碟式芯片，其型號(hào)為1X24,示意圖如圖1所示。
[0046] 所述24反應(yīng)腔碟式芯片的1#至18#反應(yīng)腔分別存放干燥的如下（1)-(18):
[0047] (1)引物對(duì)1和單鏈DNA探針I(yè) ; (2)引物對(duì)2和單鏈DNA探針2 ; (3)引物對(duì)3和 單鏈DNA探針3 ; (4)引物對(duì)4和所述DNA探針4 ; (5)引物對(duì)5和單鏈DNA探針5 ; (6)弓丨 物對(duì)6和單鏈DNA探針6 ; (7)引物對(duì)7和單鏈DNA探針7 ; (8)引物對(duì)8和單鏈DNA探針 8 ; (9)引物對(duì)9和單鏈DNA探針9 ; (10)引物對(duì)10和單鏈DNA探針10 ; (11)引物對(duì)11和 單鏈DNA探針11 ; (12)引物對(duì)12和單鏈DNA探針12 ; (13)引物對(duì)13和單鏈DNA探針13 ; (14)引物對(duì)14和單鏈DNA探針14 ; (15)引物對(duì)15和單鏈DNA探針15 ; (16)引物對(duì)16和 單鏈DNA探針16 ;(17)內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照探針；（18)陰性對(duì)照品。所述陰性對(duì)照品具 體為無 RNA酶的水（Rnase-free水）。
[0048] 其中，所述引物對(duì)I(InfAJT)用于擴(kuò)增甲型流感病毒，由序列表中序列1和序列 2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)2 (InfAJll)用于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl亞型， 由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)3 (InfA_H3)用于 擴(kuò)增甲型流感病毒H3亞型，由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成；所 述引物對(duì)4 (InfBjY)用于擴(kuò)增乙型流感病毒，由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈 DNA分子組成；所述引物對(duì)5 (RSV_TY)用于擴(kuò)增呼吸道合胞病毒，由序列表中序列9和序列 10所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)6 (HRV_TY)用于擴(kuò)增鼻病毒，由序列表中序 列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)7 (ADV_TY)用于擴(kuò)增腺病毒，由 序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)8 (PIVl)用于擴(kuò)增 副流感病毒I型，由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì) 9 (PIV2)用于擴(kuò)增副流感病毒II型，由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA分 子組成；所述引物對(duì)10 (PIV3)用于擴(kuò)增副流感病毒III型，由序列表中序列19和序列20 所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)11 (Corn_0C)用于擴(kuò)增冠狀病毒HKU1/0C43,由 序列表中序列21和序列22所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)12 (Corn_NL)用于 擴(kuò)增冠狀病毒229E/NL63,由序列表中序列23和序列24所示的兩條單鏈DNA分子組成；所 述引物對(duì)13 (hMPV_TY)用于擴(kuò)增人偏肺病毒，由序列表中序列25和序列26所示的兩條單 鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)14(Entv_TY)用于擴(kuò)增腸道病毒，由序列表中序列27和序列 28所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)15 (EV71_VP1)用于擴(kuò)增腸道病毒EV71型， 由序列表中序列29和序列30所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)16 (CA16_VP1)用 于擴(kuò)增腸道病毒CA16型，由序列表中序列31和序列32所示的兩條單鏈DNA分子組成。所 述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)（GAPD_IC)用于擴(kuò)增人基因組中管家基因 GAPDH mRNA，由序列表中序列49 和序列50所示的兩條單鏈DNA分子組成。
[0049] 所述單鏈DNA探針I(yè) (InfA_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)1的擴(kuò)增結(jié)果，其核 苷酸序列為序列表中序列33 ;所述單鏈DNA探針2 (InfA_Hl_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì) 2的擴(kuò)增結(jié)果，其核苷酸序列為序列表中序列34 ;所述單鏈DNA探針3 (InfA_H3_MB)用于 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)3的擴(kuò)增結(jié)果，其核苷酸序列為序列表中序列35 ;所述單鏈DNA探針 4 (InfB_TY_MB)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所述引物對(duì)4的擴(kuò)增結(jié)果，其核苷酸序列為序列表中序列36 ; 所述單鏈DNA