一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbCEN2及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbCEN2及其 編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] TFLl/CEN-like基因廣泛存在于開花植物中，是一類非常重要的開花抑制者。它們 通過抑制FT基因的下游花器官決定基因 APl和LFY基因，實現(xiàn)抑制開花的目的。
[0003] 在擬南芥tfll突變體中，擬南芥營養(yǎng)生長期顯著縮短，同時花序從無限花序 轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序。因此證明擬南芥T F L1基因具有同時調(diào)控營養(yǎng)生長和花序發(fā)育的功 會泛(Bradley D, Ratcliffe 0，Vincent C, Carpenter R，Coen E(1997)Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Science 275:80 - 83)。在碗豆中，兩 個TFLl-Iike基因被證明調(diào)控豌豆兩個不同的發(fā)育階段，LF基因調(diào)控維持頂端分生組織 的不確定性，而DET基因則調(diào)控花序分生組織的不確定性。因此，在lf/DET植株中，開花 期提前，但是花序的發(fā)育沒有受到影響；在LF/det植株中，開花期沒有受到影響，但花序 由無限花序轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序；在lf/det雙突變植株中，表型就像擬南芥tfll突變體一 樣，營養(yǎng)生長期和花序發(fā)育都受到嚴重影響（Foucher F，Morin J，Courtiade J，Cadioux S, Ellis N, Banfield M J, Rameau C(2003)DETERMINATE and LATE FLOWERING are two TERMINAL FL0WER1/CENTR0RADIALIS homologs that control two distinct phases of flowering initiation and development in pea. Plant Celll5:2742 - 2754)〇 而 CEN 基因，最早發(fā)現(xiàn)于模式植物金魚草中，它有非常強的組織表達特異性，當花序分生組織形成 不久就開始表達，并隨著花序的發(fā)育而逐漸增強。金魚草cen突變體植株表現(xiàn)出花序從 無限花序轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序，但營養(yǎng)生長沒有受到影響，由此說明CEN在金魚草中調(diào)控著花 序發(fā)育并維持花序分生組織不確定性（Bradley D，Carpenter R，Copsey L，Vincent C， Rothstein S，Coen E (1996)Control of inflorescence architecture in Antirrhinum. Nature379:791-797.)。而在另一個模式植物煙草中，CET2/CET4卻表現(xiàn)出不同的表達 模式，Amaya等（1999)研究表明它們只在處于營養(yǎng)生長的側(cè)芽中高表達，當煙草進入開 花時期，它們的表達受到NFL基因抑制并逐漸降低。說明CET2/CET4對營養(yǎng)器官發(fā)育的 維持有非常重要的作用（Amaya I，Ratcliffe 0 J，Bradley D J(1999)Expression of CENTRORADIALIS(CEN)and CEN-Iike genes in tobacco reveals a conserved mechanism controlling phase change in diverse species. Plant Cell 11:1405 - 1418)。
[0004] 以上研究結果表明，TFLl/CEN-like基因?qū)χ参餇I養(yǎng)生長和/或生殖發(fā)育的調(diào)控 起著非常重要的作用。巴西橡膠樹有著長達5-8年的營養(yǎng)生長期，研究不同TFLl/CEN-like 基因在橡膠樹中的機理有助于對橡膠樹生長期進行有效調(diào)控。目前，在巴西橡膠樹中，尚未 有關TFLl/CEN-like基因的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白 HbCEN2及其編碼基因與應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbCEN2,其氨基 酸序列如SEQ ID No. 15所示。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述蛋白的編碼基因。
[0008] 進一步地，其核苷酸序列為SEQ ID No. 13中的120bp~641bp所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種來自橡膠樹的開花調(diào)控基因 HbCEN2,其cDNA序列如SEQ ID No. 13所示。
[0010] 進一步地，其DNA序列如SEQ ID No. 14所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了含有前述編碼基因的載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了含有前述載體的工程菌。
[0013] 本發(fā)明進一步提供了前述編碼基因與前述基因在延遲植株開花方面的應用。
[0014] 進一步地，所述應用為將所述工程菌侵染植株，獲得開花期延遲的轉(zhuǎn)基因植株。
[0015] 主要特征表現(xiàn)在輪座葉和主枝節(jié)點數(shù)明顯增多，花器官出現(xiàn)缺失，導致角果異常， 結實率降低。最嚴重的可引起轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不開花表型。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 本發(fā)明首次公開了 5個開花調(diào)控基因，即TFLl/CEN-like同源基因，它們在橡膠樹 營養(yǎng)器官中有著不同的表達模式：
[0018] 1)對于TFLl-Iike同源基因來說，HbTFLl-I主要在根和穩(wěn)定葉中表達，HbTFLl-2 主要在根中特異表達，而HbTFLl-3則在莖和頂端分生組織中表達。另外它們有一個共同的 表達特點，就是在開花期（每年的3月份），3個基因在處于生殖生長階段植株中的各自的 營養(yǎng)器官中的表達明顯低于處于童期營養(yǎng)生長的植株。在花序發(fā)育過程中，3個基因的表達 都隨著花序的發(fā)育而逐漸升高，但在開花的雄花和雌花中卻表現(xiàn)著不同的相對表達量，其 中，HbTFLl-I在雄花和雌花中表達差不多，HbTFLl-2在雌花中表達明顯高于在雄花中的表 達；而HbTFLl-3則在雄花中的表達非常顯著的高于雌花中的表達。
[0019] 2)對于CEN-Iike同源基因來說，它們在橡膠樹營養(yǎng)器官中有著類似的表達模式， 但不完全相同。在3個月大小苗中二者主要在根、莖和芽中表達。在生長發(fā)育過程中，二者 表現(xiàn)出的表達趨勢分為三種。第一，在根中，二者都隨著年齡增加表達逐漸降低，在2年樹 中降低為零。第二，在莖中，二者表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；在芽中，HbCENl表現(xiàn)出先升 高后降低的表達趨勢，而HbCEN2則表現(xiàn)出隨著年齡增加逐漸降低的趨勢。在花序發(fā)育過程 中，二者表現(xiàn)出相似的表達模式，即隨著花序的發(fā)育它們的表達逐漸降低，尤其是HbCENl， 表達趨勢非常明顯。
[0020] 另外，分別將5個基因分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株在營 養(yǎng)生長期和花期都有明顯的延長。主要特征表現(xiàn)為輪座葉和主枝節(jié)點數(shù)明顯增多，花器官 出現(xiàn)缺失，導致角果異常，結實率降低。最嚴重的可引起轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不開花表型。再將 5個基因分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入tfll-Ι突變體中，結果，5個基因皆能有效地將tfll-Ι突變表型恢 復為野生型表型，有些還出現(xiàn)了嚴重的延遲營養(yǎng)生長期和花期的表型，更有甚者出現(xiàn)了不 開花現(xiàn)象。
[0021] 因此，這5個基因可作為巴西橡膠樹開花調(diào)控的重要候選基因，通過對巴西橡膠 樹的遺傳轉(zhuǎn)化有望實現(xiàn)對巴西橡膠樹花期調(diào)控。同樣，也可在其他農(nóng)作物中應用，解決近緣 種或者不同品種雜交時花期不育帶來的一系列問題，另外也可對生育期進行調(diào)控。
【附圖說明】
[0022] 圖1為3個TFLl-Iike基因組織特異性表達和時空表達分析。其中A為HbTFLl-I 基因時空表達模式分析；B為HbTFLl-2基因時空表達模式分析；C為HbTFLl-3基因時空表 達模式分析。
[0023] 圖2為2個CEN-Iike基因組織特異性表達和時空表達分析。其中A為HbCENl基 因時空表達模式分析；B為HbCEN2基因時空表達模式分析。
[0024] 圖3為3個TFLl-Iike基因在花序5個不同發(fā)育階段的表達分析。I，第一發(fā)育階 段的花序；II，第二發(fā)育階段的花序；III，第三發(fā)育階段的花序；IV，第四發(fā)育階段的花序； V，第五發(fā)育階段的花序；A為HbTFLl-I基因表達分析；B為HbTFLl-2基因表達分析；C為 HbTFL 1-3基因表達分析。
[0025] 圖4為2個CEN-Iike基因在花序5個不同發(fā)育階段的表達分析。I，第一發(fā)育階 段的花序；II，第二發(fā)育階段的花序；III，第三發(fā)育階段的花序；IV，第四發(fā)育階段的花序； V，第五發(fā)育階段的花序；A為HbCENl基因表達分析；B為HbCEN2基因表達分析。
[0026] 圖5為野生型擬南芥分別與轉(zhuǎn)3個TFLl-Iike基因植株開花表型比較。其中A為 野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-I基因開花表型比較；B為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-2基 因植株開花表型比較；C為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-3基因植株開花表型比較。
[0027] 圖6為野生型擬南芥分別與轉(zhuǎn)2個CEN-Iike基因植株開花表型比較。其中A為 野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbCENl基因開花表型比較；B為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbCEN2基因植 株開花表型比較。
[0028] 圖7為擬南芥tf 11-1突變體轉(zhuǎn)化3個TFLl-Iike基因的恢復驗證實驗。
[0029] 圖8為擬南芥tf 11-1突變體轉(zhuǎn)化2個CEN-Iike基因的恢復驗證實驗。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031 ] 實施例1巴西橡膠樹5個目標基因的獲得
[0032] 根據(jù)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所的橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 庫，通過同源比對的方式獲得的contig，然后進行拼接，再通過NCBI在線軟件預測開放閱 讀并設計特異引物獲得包含有完整開放閱讀框的DNA序列和cDNA序列。
[0033] 具體方法如下：
[0034] 5個基因開放閱讀框的獲得
[0035] 5個基因特異引物如下：

[0046] 分別以 HbTFLl-IOF(EcoRI)和 HbTFLl-IOR(XbaI)， HbTFLl-20F(EcoRI)和 HbTFLl-20R (XbaI)，HbTFLl-30F (EcoRI)和 HbTFLl-30R (XbaI)，HbCEN10F (EcoRI)和 HbCENlOR(XbaI)，HbCEN20F(EcoRI)和HbCEN20R(XbaI)組成為引物對，每個引物對再分別 以橡膠樹根，葉片，芽和花序的cDNA為模版，分別擴增5個