與人鼻咽癌lmp2a結(jié)合的適配子及其構(gòu)成的生物芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體的說，設(shè)及一種與人鼻咽癌LMP2A具有特異性結(jié)合的 適配子及構(gòu)成的生物巧片。
【背景技術(shù)】
[0003] 鼻咽癌是來源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，腫瘤進(jìn)展極易侵犯顧底等重要結(jié)構(gòu)， 并較早發(fā)生頸部淋己結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌表現(xiàn)為種族和地區(qū)分布的特點(diǎn)，是我 國十大高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為20/100, 000,已引發(fā)嚴(yán)重健康問題。鼻咽癌是由 Epstein-Barr病毒巧BV)的潛伏感染、環(huán)境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟 交互作用而逐步形成的復(fù)雜性疾病。所有的鼻咽癌細(xì)胞都含有邸V基因組，并表達(dá)邸NA1， E邸R1,邸邸2,和LMP1，LMP2A，LMP2B，該使得該些病毒蛋白成為理想的腫瘤標(biāo)志物，其中 latentmembraneprotein2A(LMP2A)在鼻咽上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、癌變和復(fù)發(fā)的過程中的作 用倍受關(guān)注，是目前公認(rèn)的病毒癌基因。它W其獨(dú)特的蛋白分子結(jié)構(gòu)參與鼻咽癌發(fā)生和發(fā) 展的全過程。
[0004]SELEX技術(shù)，又指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化（systematicevolutionofligands byexponentialenrichment,SELE)〇是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一項(xiàng)組合化學(xué)技術(shù)。DNA 配體與RNA配體的篩選過程雖然有一點(diǎn)不同，但一般都包括W下幾個步驟；（1)通過人工合 成，建立dsDNA隨機(jī)序列庫?？?與祀物質(zhì)反應(yīng)，篩選出相互結(jié)合的祀物質(zhì)-核酸復(fù)合體。（3) 將篩選到的蛋白-核酸復(fù)合物分離，得到的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性成單鏈W準(zhǔn)備進(jìn)行下一 輪篩選，篩選的次數(shù)由文庫的類型和每次循環(huán)所得特異性序列的富集程度決定。（4)經(jīng)過若 干輪篩選得到的、能高度結(jié)合祀物質(zhì)的核酸配體可W進(jìn)行測序并用于各種研究工作。具有 庫容量大，祀分子范圍廣，親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的抗體相比， 寡核巧酸適配子還具與祀分子結(jié)合力更強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精確性高、重復(fù)性好、可反復(fù)使用、可 長期保存、可進(jìn)行精確的位點(diǎn)修飾、篩選期更短等優(yōu)勢，是一種高效、快速的檢測手段。
[0005] 近年來表面等離子體共振（surfaceplasmonresonance,SPR)技術(shù)因其具有實(shí) 時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程、靈敏度較高、無需標(biāo)記、無背景干擾、成本低廉等特點(diǎn)，被認(rèn)為是生物 分子檢測的理想檢測器件，已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。基本原理是一種物理 光學(xué)現(xiàn)象。表面等離子體（S巧是沿著金屬和電介質(zhì)間界面?zhèn)鞑サ碾姶挪ㄐ纬傻?。?dāng)平行表 面的偏振光W稱之為表面等離子體共振角入射在界面上，發(fā)生衰減全反射時，入射光被禪 合入表面等離子體內(nèi)，光能大量被吸收，在該個角度上由于表面等離子體共振引起界面反 射光顯著減少。由于SPR對金屬表面電介質(zhì)的折射率非常敏感，不同電介質(zhì)其表面等離子 體共振角不同。同種電介質(zhì)，其附在金屬表面的量不同，則SPR的響應(yīng)強(qiáng)度不同?；谠摲N 原理的生物傳感器通常將一種具特異識別屬性的分子即配體固定于金屬膜表面，監(jiān)控溶液 中的被分析物與該配體的結(jié)合過程。在復(fù)合物形成或解離過程中，金屬膜表面溶液的折射 率發(fā)生變化，隨即被SPR生物傳感器檢測出來。與傳統(tǒng)的化ISA檢測法相比，SPR生物傳感 器具有如下顯著特點(diǎn)；（1)實(shí)時檢測，能動態(tài)地監(jiān)測生物分子相互作用的全過程；（2)無需 標(biāo)記樣品，保持了分子活性；（3)樣品需要量極少；(4)檢測過程方便快捷，靈敏度高；(5) 應(yīng)用范圍非常廣泛；(6)高通量、高質(zhì)量的分析數(shù)據(jù)；（7)大多數(shù)情況下，不需對樣品進(jìn)行預(yù) 處理；（8)能檢測混濁的甚至不透明的樣品?，F(xiàn)在已廣泛用于物理量檢測，化學(xué)檢測與生物 監(jiān)測。
[0006] 如果能篩選出鼻咽癌LMP2A的適配子，然后將其包被在生物巧片上，再結(jié)合SH?生 物傳感器進(jìn)行檢測，將非常的快捷和精確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種與鼻咽癌LMP2A結(jié)合力更 強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精確性高、重復(fù)性好的適配子。
[0008] 本發(fā)明目的之二在于提供一種與鼻咽癌LMP2A具有特異性的適配子所構(gòu)成的生 物巧片。
[0009] 本發(fā)明目的是該樣實(shí)現(xiàn)的；一種與鼻咽癌LMP2A具有特異性的適配子，其特征在 于；他具有SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 13的序列之一。
[0010] 一種由與鼻咽癌LMP2A具有特異性的適配子構(gòu)成的的生物巧片，包括玻璃基底 (I)，玻璃基底（I)上依次附著有金膜（2)、連接層（3)和表面基質(zhì)（4)，所述金膜（2)的流池 包被有SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 13序列的適配子。
[0011] 上述金膜口)在包被適配子前，先預(yù)處理，即在1.Omol/L化OH中浸泡清洗20min， 取出后用去離子水清洗3次，然后放入Piranha溶液中處理15min，取出后立即投入無水 己醇中浸泡5min，氮?dú)獯蹈伞?br>[0012] 上述適配子包被在金膜（2)上之前，先預(yù)處理，即先將適配子溶解到PBS緩沖液， 95°C變性3min,迅速冰浴2min,隨后琉基法進(jìn)行固定。
[0013] 鼻咽癌LMP2A適配子經(jīng)過W下方法制備篩選得到： 構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物；構(gòu)建長度為83個堿基的ssDNA文庫，兩端為固 定序列，中間40個核巧酸為隨機(jī)序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一個；5'-GCGTGCTCA TAACAGACGATCAG-N40-CTCGACGTGAGCACCAGAGCA-3 '。
[0014] 上游引物為 5, -GCGTGCTCATAACAGACGATCAG-3 '，下游引物為 5 ' -TGCTCTGGTGCTCACGTCGAG-3 '。下游引物序列5'端需用生物素標(biāo)記。隨機(jī)單鏈DNA文庫 和引物可由引物合成公司合成。
[00巧]雙鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴(kuò)增及回收； 單鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴(kuò)增及回收； 采用不對稱PCR進(jìn)行擴(kuò)增； S化EX篩選 鼻咽癌LMP2A蛋白的制備，采用CN103102412A的方法，表達(dá)得到目的蛋白。
[0016] 包被蛋白，ssDNA文庫的結(jié)合，簡單洗脫，強(qiáng)化洗脫，精煉ssDNA，測定親和性，將純 化后的目的基因PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-Tsimplevector連接，測序。
[0017] 適配子包被生物巧片 我們在表面基質(zhì)上包被親和性最強(qiáng)的適配子，然后結(jié)合SH?生物傳感器進(jìn)行檢測。
[0018] 有益效果：本發(fā)明與傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的抗體相比，寡核巧酸適配子還具與祀分子 結(jié)合力更強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精確性高、重復(fù)性好、可反復(fù)使用、可長期保存、可進(jìn)行精確的位點(diǎn) 修飾、篩選期更短等優(yōu)勢；所得到的生物巧片放入SPR生物傳感器檢測，能實(shí)現(xiàn)（I)實(shí)時檢 測、（2)無需標(biāo)記樣品、（3)樣品需要量極少、（4)檢測過程方便快捷，靈敏度高、（5)應(yīng)用范 圍非常廣泛、（6)高通量、（7)大多數(shù)情況下、（8)能檢測混濁的甚至不透明的樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1適配子的獲得 構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物；構(gòu)建長度為83個堿基的ssDNA文庫，兩端為固 定序列，中間40個核巧酸為隨機(jī)序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一個；5'-GCGTGCTCA TAACAGACGATCAG-N40-CTCGACGTGAGCACCAGAGCA-3 '。
[0020] 上游引物為引物1 ; 5，-GCGTGCTCATAACAGACGATCAG-3 '，下游引物為引物2 ; 5 ' -TGCTCTGGTGCTCACGTCGAG-3 '。下游引物序列5'端需用生物素標(biāo)記。隨機(jī)單鏈DNA文 庫和引物可由引物合成公司合成。
[0021] 雙鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴(kuò)增及回收； PCR反應(yīng)體系
一共進(jìn)行19個循環(huán)，最后72°C延伸5min.，得到的產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(或4°C保存）PCR產(chǎn)物純化及回收：往DNA溶液中加入0. 1倍體積的3mol/LP冊.2的己酸鋼和2-2. 5 倍體積的冰冷無水己醇，在蝸旋混合振蕩器上振蕩混勻并置于-20°C冰箱里放置30min，然 后1200化pm離屯、5min，棄上清，加入Iml預(yù)冷的70 %己醇，顛倒離屯、管數(shù)次，12000巧m離 屯、5min，棄上清，驚干沉淀后網(wǎng)置于烘箱lOmin)溶于20yLTE緩沖液（pH8. 0)或(1化0， 4 °C保存過夜。
[002引單鏈DNA(dsDNA)文庫的PCR擴(kuò)增及回收； 采用不對稱PCR進(jìn)行擴(kuò)增， PCR反應(yīng)體系
一共進(jìn)行40個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin.，得到的產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(或4°C保存） 回收方法同雙鏈DNA(dsDNA)文庫的回收。
[0023] 瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果 配制2%的瓊脂糖凝膠：精確稱取2g電泳級瓊脂糖，加入100mlIXTAE電泳緩沖液，在 微波爐內(nèi)加熱至溶化，待凝膠冷卻至55°C左右時，加入漠化己錠(終濃度為0. 5yg/mL)輕 輕旋轉(zhuǎn)搖勻，倒入膠膜，插入合適的