一種果蔗芽變的分子鑒定方法及其專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學分子標記領域，設及一種果庶芽變的分子鑒定方法及其專用引 物。
【背景技術】
[0002] 芽變，是植物體細胞內遺傳物質發(fā)生改變，該種改變往往發(fā)生在芽的分生組織細 胞中，當芽萌發(fā)成新植株時，即表現(xiàn)出新個體與原類型在性狀上有所不同。所W，芽變?yōu)橹?物新品種選育提供了一條重要途徑。
[0003]果庶在我國具有悠久的種植歷史，分布范圍也較廣。目前我國生產上使用的果庶 品種可分為二大類，一是果庶專用型品種，二是果糖兼用型品種。其中拔地拉栽培面積最 大，W我國果庶栽培面積最大的廣西為列，拔地拉種植面積占果庶種植總面積的90%W上， 地方果庶品種如青皮庶、白皮庶、黃皮果庶、福建蠟庶等的種植面積占不到總面積的10%。 拔地拉原產熱帶地區(qū)，對水溫肥等條件要求較高，在生長過程中對環(huán)境條件比較敏感，其主 要表現(xiàn)是常因水肥管理偏差導致生長受抑制而出現(xiàn)短節(jié)現(xiàn)象，嚴重影響其商品性。為克服 此問題，目前在栽培管理過程中，庶農通過施用大量水肥及植物生長調節(jié)劑，使得果庶節(jié)間 長度達到一定長度，從而提高拔地拉的商品性。
[0004]目前果庶新品種選育主要是利用糖庶品種作為親本進行常規(guī)雜交選育，并育成 了一批果糖兼用品種，但品質低于拔地拉。發(fā)明人經研究發(fā)現(xiàn)，將新型SCoT(Start codon targeted polymo巧hism)標記技術應用到果庶拔地拉及其芽變類型的分子鑒定中，雖然 PCR擴增效果非常好，但所用引物難W檢測到遺傳差異，不能對果庶拔地拉及其芽變類型進 行分子鑒定，如圖1所示。
[0005] 因此，鑒于中國果庶品種現(xiàn)狀及存在問題，從果庶自然突變株中系統(tǒng)選育果庶新 品種，W期育成高產、穩(wěn)產、優(yōu)質、抗病、適應性廣、應用前景好的果庶新品種，是果庶生產的 當務之急。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對W上技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種果庶芽變的分子鑒定方法及其專用 引物，W便從果庶拔地拉自然突變株中有效、快速的鑒定出果庶芽變品種。
[0007] 對此，本發(fā)明的技術方案為；
[0008]-種果庶芽變的分子鑒定的專用引物，所述專用引物為序列表SEQIDNO: 1核巧 酸序列的引物，所述專用引物為URPOJniversal化cePrimer)標記單引物。
[0009] 所述專用引物的核巧酸序列為：
[0010]URP38F；AAGAGGCATTCTACCACCAC〇
[0011] 所述專用引物W下統(tǒng)稱為URP38F。
[0012] 一種果庶芽變的分子鑒定方法，包括W下步驟：提取果庶親本拔地拉及對應的疑 似芽變果庶品種的基因組DNA，用所述專用引物即URP38F分別對基因組DNA進行PCR擴增， PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳W區(qū)分親本拔地拉及其對應的疑似芽變果庶品種，果庶 親本拔地拉與其對應的疑似芽變果庶之間的電泳條帶模式在625bp處有強度差異，疑似芽 變果庶品種為真實芽變品種。
[0013] 作為本發(fā)明的進一步地改進，所述PCR擴增的程序是；94°C預變性4min;94°C變性 30s，50°C退火Imin，72°C延伸1. 5min，其中，變性、退火、延伸S個步驟循環(huán)35次；72°C最后 一步延伸10min，10°C保存。
[0014] 作為本發(fā)明的進一步地改進，所述PCR擴增體系為20ul，包括；10XPCR含Mg"的 Buffer2.0ul，2. 5mM的dNTP0. 5ul，lOpmol/ul的URP38Flul，2. 5U/ul的Taq酶 0.加1， 50ng/ul的DM模板 1.Oul，d地2〇 補足。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步地改進，所述果庶的基因組DM從果庶植株的嫩葉中提取。
[0016] 作為本發(fā)明的進一步地改進，所述提取果庶基因組DNA的方法，包括W下步驟：
[0017] 步驟A;取新鮮果庶嫩葉，放入研鉢中并在研鉢中加入PVP(聚己締化咯燒酬），加 入液氮，將葉片充分研磨成粉末狀樣品；
[0018] 步驟B;將所述粉末狀樣品轉移到裝有預熱的CTAB(十六烷基=甲基漠化錠）提 取液的離屯、管中，并加入0-琉基己醇，于65°C水浴鍋中溫浴60min，混勻；
[001引步驟C;將步驟B的離屯、管置于4°C冷凍離屯、機中，12000巧m離屯、lOmin后，吸取 上清液，并在上清液中加入RNaseA(核糖核酸酶A)，混勻，靜置5min;
[0020] 步驟D;加入與步驟C所述的上清液等體積的氯仿，抽提，混勻，靜置5min，冷凍離 屯、機中12000巧m離屯、lOmin;
[0021] 步驟E;再次吸取上清液，并再次加入等體積的氯仿抽提，于冷凍離屯、機中 12000巧m離屯、lOmin;
[0022] 步驟F;吸取上清液，并加入等體積的-40°C的無水己醇，于-40°C冰箱中沉淀 30min，將沉淀物取出放入到新的離屯、管中，用75%己醇洗漆；
[0023] 步驟G;驚至無己醇味后，用200ulDEPC水或TE緩沖液溶解沉淀物。
[0024] 作為本發(fā)明的進一步地改進，所述步驟F中，采用白色小槍頭或牙簽將沉淀物取 出。
[00巧]進一步優(yōu)化的，所述果庶植株基因組DNA的提取方法，包括W下步驟：
[0026] 1)取新鮮果庶嫩葉0. 3-0. 5g，用經高壓滅菌后的干凈剪刀剪碎，放入研鉢中并在 研鉢中加入Ig的PVP(聚己締化咯燒酬），分多次倒入足量的液氮，將葉片樣品充分研磨成 粉末狀；
[0027] 2)將全部粉末樣品轉移到事先加入了 1.OmlCTAB(十六烷基S甲基漠化錠）提 取液且經過65°C預熱的2ml離屯、管中，再加入20y1 0 -琉基己醇，于65°C水浴鍋中溫浴 60min，期間上下顛倒混勻，W便DNA充分析出；
[0028] 3)將離屯、管置于4°C冷凍離屯、機中，12000巧m離屯、lOmin后除去底部殘渣，吸取上 清液到新的干凈的離屯、管中，并在上清液中加入0. 5ul的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分 顛倒混勻，靜置5min;
[0029] 4)加入與上清液等體積的氯仿抽提，上下充分顛倒混勻，靜置5min，4°C冷凍離屯、 機中12000巧m離屯、lOmin;
[0030]5)吸取上清液，并再次加入與上清液等體積的氯仿抽提，4°C冷凍離屯、機中 12000巧m離屯、lOmin;
[0031] 6)吸取上清液并加入與上清液等體積且事先在-40°c預冷的無水己醇于-40°c冰 箱中沉淀30min，用白色小槍頭或牙簽將沉淀挑出來到新的干凈的1. 5ml離屯、管中，用75% vol己醇洗漆沉淀二遍；
[0032] 7) 5min左右驚干后，用200y1DEPC(焦碳酸二己醋）水或TE緩沖溶液溶解沉淀。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種用于果庶芽變分子鑒定的試劑盒，所述試劑盒含有URP38F 引物。
[0034] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為；
[00巧]采用本發(fā)明的技術方案，可W有效地、快速地從果庶拔地拉自然突變株中鑒定出 芽變品種，為進一步育成高產、穩(wěn)產、優(yōu)質、抗病、適應性廣、應用前景好的果庶新品種奠定 了基礎；且本發(fā)明的鑒定方法具有較強的通用性，為有效選擇變異奠定了理論基礎和提供 了技術支撐，操作簡便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和物力，便于推廣。
【附圖說明】
[0036] 圖1是本發(fā)明現(xiàn)有技術的果庶親本拔地拉及其對應的4個芽變品種的SCoT標記 技術鑒定的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中所用單引物分別為5(：〇16、5(：〇19和5(：〇1'12，編號 1-5分別對應拔地拉、芽變3號、芽變1號、芽變2、芽變4號；
[0037] 圖2是本發(fā)明一種實施例果庶親本拔地拉及其對應的4個芽變品種的URP標記技 術鑒定的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中所用單引物分別為URP2F、URP9F、URP38F和URP4R， 編號1-5分別對應拔地拉、芽變3號、芽變1號、芽變2、芽變4號；
[0038] 圖3是本發(fā)明一種實施例果庶親本拔地拉及其對應的4個芽變品種的URP標記技 術重復鑒定的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中所用單引物為URP38F，編號1-5分別對應拔地 拉、芽變3號、芽變1號、芽變2、芽變4號。
[0039]圖中，M為DNAMarkerDL2000,從上到下條帶大小依次為 2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp和lOObp。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合附圖，對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細說明。
[00川實施例1
[0042]材料；
[0043] 本實施例選取拔地拉、芽變3號、芽變1號、芽變2、芽變4號五個品種進行對比分 析。其中，拔地拉為果庶親本品種，芽變3號、芽變1號、芽變2、芽變4號為疑似芽變果庶品 種。
[0044] 步驟一，提取親本果庶拔地拉及疑似芽變果庶品種的基因組DNA，包括W下步驟：
[0045] 1)取新鮮果庶嫩葉0. 3-0. 5g，用經高壓滅菌后的干凈剪刀剪碎，放入研鉢中并在 研鉢中加入Ig的PVP(聚己締化咯燒酬），分多次倒入足量的液氮，將葉片樣品充分研磨成 粉末狀；
[0046] 2)將全部粉末樣品轉移到事先加入了 1.OmlCTAB(十六烷基S甲基漠化錠）提 取液且經過65°C預熱的2ml離屯、管中，再加入20y1 0 -琉基己醇，于65°C水浴鍋中溫浴 60min，期間上下顛倒混勻，W便DM充分析出；
[0047] 3)將離屯、管置于4°C冷凍離屯、機中，12000巧m離屯、lOmin后除去底部殘渣，吸取上 清液到新的干凈的離屯、管中，并在上清液中加入0. 5ul的RNaseA(核糖核酸酶