A)，上下充分 顛倒混勻，靜置5min;
[0048] 4)加入與上清液等體積的氯仿抽提，上下充分顛倒混勻，靜置5min，4°C冷凍離屯、 機(jī)中12000巧m離屯、lOmin;
[0049] 5)吸取上清液，并再次加入與上清液等體積的氯仿抽提，4°C冷凍離屯、機(jī)中 12000巧m離屯、lOmin;
[0050] 6)吸取上清液并加入與上清液等體積且事先在-40°C預(yù)冷的無水己醇于-40°C冰 箱中沉淀30min，用白色小槍頭或牙簽將沉淀挑出來到新的干凈的1. 5ml離屯、管中，用75% vol己醇洗漆沉淀二遍；
[005U 7) 5min左右驚干后，用200y1DEPC水或TE溶解沉淀。
[0052] 親本果庶拔地拉及疑似芽變果庶品種提取均按照此方法提取各自的基因組DNA。
[0053] 步驟二，利用URP標(biāo)記引物分別對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳W(wǎng)區(qū)分芽變，親本果庶拔地拉及疑似芽變品種之間的電泳條帶模式有差 異，疑似芽變品種為真實芽變品種，詳見圖2和圖3 ;
[0054] 所述的URP標(biāo)記引物是URP38F，所述URP38F的引物核巧酸序列為： AAGAGGCATTCTACCACCAC；
[00巧]所述PCR擴(kuò)增的程序是；94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延 伸1.5min，其中，變性、退火、延伸=個步驟循環(huán)35次；72°C最后一步延伸10min，10°C保 存；
[005引 所述PCR擴(kuò)增體系為20ul，包括；10XPCR含Mg"的Buffer2.Oul，各2. 5mM的 dNTP0. 5ul，lOpmol/ul的URP38F引物lul，2.抓All的Taq酶 0.加1，50ng/ul的DM模板 1.Oul，(1地20補足剩下的15ul。
[0057]步驟S，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4ul電泳上樣緩沖液混勻，取6ul擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1XTAE， EB(漠化己錠）染色后，膠塊在凝膠成像系統(tǒng)的UV下進(jìn)行顯色觀察并拍照。
[005引起初，我們對12條URP標(biāo)記單引物進(jìn)行了初步篩選，緊接著，我們對擴(kuò)增效果更好 的4條單URP標(biāo)記引物再次進(jìn)行了擴(kuò)增，令人非常興奮的是，我們觀察到單引物URP38F能 檢測到差異，該差異是由于其中的一條條帶亮度的強弱引起的，該條帶在大約625bp處（界 于500bp和750bp之間），如圖2所示。
[0059] 為了進(jìn)一步驗證單引物URP38F在第一輪PCR篩選中體現(xiàn)出來的真實性，W判定擴(kuò) 增出的差異條帶不是由于樣品基因組DNA中的該片段拷貝數(shù)差異引起的，我們對樣品DNA 模板的用量進(jìn)行了調(diào)整，成倍地調(diào)大了在大約625bp處條帶弱的樣品DNA的使用量，并進(jìn)行 了多次PCR重復(fù)擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，依然觀察到單引物URP38F能檢測到在大約62化P 處的一條條帶亮度的強弱引起的差異，該URP38F引物可用于果庶親本拔地拉及其對應(yīng)的 芽變品種的分子鑒定。
[0060] 實施例2
[0061] 對實施例1中鑒定出的芽變1號進(jìn)行培育，于橫縣云表鎮(zhèn)、賓陽古辣鎮(zhèn)、武鳴雙橋 鎮(zhèn)、博白s灘鎮(zhèn)、田東縣祥周鎮(zhèn)、龍州上龍鄉(xiāng)等多點進(jìn)行兩年的試驗種植，與拔地拉相比，農(nóng) 藝性狀結(jié)果如下表1所示。
[0062] 表1芽變1號大田兩年多點試種的農(nóng)藝性狀結(jié)果及其與果庶拔地拉的比較
[0063]
[0064] 從表1可見，育成的芽變1號發(fā)芽率92. 24%，略低于拔地拉的92.96% ;株高 255. 61厘米，比拔地拉的227. 95厘米高27. 66厘米；莖徑3. 54厘米，比拔地拉的3. 67細(xì) 0. 13厘米；每公頃商品庶數(shù)47834條，比拔地拉的45079條多2755條。說明該品種萌芽率 高，商品庶數(shù)多，單莖較重。
[006引芽變1號公頃商品庶產(chǎn)量120. 18噸，比拔地拉的110. 94噸增產(chǎn)9. 71噸。芽變1 號公頃商品庶最高產(chǎn)量最高可達(dá)180噸。另外，在玉州區(qū)、當(dāng)寧區(qū)、隆安、大新、融水、陽朔及 廣東、湖南、河南等地試種，普遍表現(xiàn)良好，產(chǎn)量及商品庶質(zhì)量均優(yōu)于拔地拉，表現(xiàn)出較好的 適應(yīng)性。
[0066] 對芽變1號和拔地拉的品質(zhì)分析進(jìn)行比較，結(jié)果：芽變1號的庶糖分12. 93%、纖 維分7. 42%、出汁率83. 74%、鍵度14. 86%、庶渣水分50. 88%，與拔地拉對應(yīng)指標(biāo)與差別 較小，詳見下表2。
[0067] 表2芽變1號和拔地拉的品質(zhì)分析比較表
[0068]
[0069] 對芽變1號和拔地拉的節(jié)間長度均勻度進(jìn)行了比較分析，詳見下表3。芽變1號 商品性較低的節(jié)間數(shù)較少，長度《5. 9cm的節(jié)間數(shù)占總節(jié)間數(shù)0. 67%，拔地拉占5. 43%;長 度6. 0~7. 9cm的節(jié)間數(shù)芽變1號占9. 21%，拔地拉占19. 12% ;商品性較高的節(jié)間長度， 長度8. 0~13. 9cm的芽變1號占84. 75%，拔地拉占71. 34% ;商品性稍次的節(jié)間長度，長 度> 14. 0cm的芽變1號占5. 28%，拔地拉占4.09%。
[0070] 表3芽變1號和拔地拉的節(jié)間長度分級比較表
[0071] (單位；cm)
[0072]
[0073] 因此，芽變1號不論節(jié)間長度還是莖徑大小，其均勻度高于拔地拉，外觀質(zhì)量好， 其商品性價比較高。
[0074] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于該些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種果蔗芽變的分子鑒定的專用引物，其特征在于：所述專用引物為序列表SEQ ID NO: 1核苷酸序列的引物。2. -種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：提取果蔗親本拔地拉 及對應(yīng)的疑似芽變果蔗品種的基因組DNA，采用如權(quán)利要求1所述專用引物分別對基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以區(qū)分芽變，果蔗親本拔地拉與其對應(yīng) 的疑似芽變果蔗品種之間的電泳條帶模式在625bp處有強度差異，疑似芽變果蔗品種為真 實芽變品種；所述專用引物為URP38F引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增 的程序是：94°〇預(yù)變性4!^11 ;941：變性3〇8,5〇1：退火1111111，721：延伸1.5111111，其中，變性、 退火、延伸三個步驟循環(huán)35次；72°C最后一步延伸lOmin，KTC保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增 體系為 20ul，包括：10XPCR 含 Mg2+的 Buffer 2.0ul，2.5mM 的 dNTP 0.5ul，10pmol/ul 的 URP38F 引物 I. 0ul，2. 5U/ul 的 Taq 酶 0? 5ul，50ng/ul 的 DNA 模板 1.0 ul，CldH2O 補足。5. 根據(jù)權(quán)利要求2~4任意一項所述的一種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于：所 述果蔗的基因組DNA從果蔗植株的嫩葉中提取。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于：所述提取果蔗 基因組DNA的方法，包括以下步驟： 步驟A :取新鮮果蔗嫩葉，放入研缽中并在研缽中加入PVP，加入液氮，將葉片充分研磨 成粉末狀樣品； 步驟B :將所述粉末狀樣品轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)熱的CTAB提取液的離心管中，并加入13-巰基 乙醇，于65°C水浴鍋中溫浴60min，混勻； 步驟C :將步驟B的離心管置于冷凍離心機(jī)中，12000rpm離心10min后，吸取上清液，并 在上清液中加入RNaseA，混勾，靜置5min ; 步驟D :加入與步驟C所述的上清液等體積的氯仿，抽提，混勾，靜置5min，冷凍離心機(jī) 中 12000rpm 離心 IOmin ; 步驟E :再次吸取上清液，并再次加入與上清液等體積的氯仿抽提，于冷凍離心機(jī)中 12000rpm 離心 IOmin ; 步驟F :吸取上清液，并加入與上清液等體積的-40°C的無水乙醇，于_40°C冰箱中沉淀 30min，將沉淀物取出放入到新的離心管中，用75%乙醇洗滌； 步驟G :晾至無乙醇味后，用200ul DEPC水或TE緩沖液溶解沉淀物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種果蔗芽變的分子鑒定方法，其特征在于：所述步驟F中， 采用白色小槍頭或牙簽將沉淀物取出。8. -種用于果蔗芽變分子鑒定的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有權(quán)利要求1所 述的專用引物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種果蔗芽變的分子鑒定方法及其專用引物，所述果蔗芽變的分子鑒定的專用引物為序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列的引物；所述果蔗芽變的分子鑒定方法包括以下步驟：提取果蔗親本拔地拉及對應(yīng)的疑似芽變果蔗品種的基因組DNA，采用所述專用引物分別對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以區(qū)分芽變，果蔗親本拔地拉及對應(yīng)的疑似芽變果蔗品種的電泳條帶模式在625bp處有強度的差異，疑似芽變果蔗品種為真實芽變品種。采用本發(fā)明的技術(shù)方案能有效地、快速地從果蔗自然突變株中鑒定出芽變品種，為有效選擇變異奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，操作簡便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和物力，便于推廣。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104988147
【申請?zhí)枴緾N201510386947
【發(fā)明人】劉俊仙, 熊發(fā)前, 李松, 劉紅堅, 劉麗敏, 劉欣, 余坤興, 淡明, 盧曼曼, 楊柳
【申請人】廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月3日