一種Aβ1-42單體及其制備、鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及β -淀粉樣蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種Αβ 1-42單體及其制備、鑒定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' S disease，AD)也稱為老年癡呆癥，是發(fā)生在老年期 或老年前期的一種慢性、持續(xù)性、退化性的腦變性疾病，其臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙、 人格改變等。該病的病理特征主要包括大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域的細(xì)胞外出現(xiàn)以淀粉樣蛋 白（beta-amyloid, Αβ)為核心的老年斑、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)等病變。在美國AD是僅 次于心血管病、癌癥和腦卒中的第四大死亡殺手，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全世界AD發(fā)病人數(shù)高達(dá)2500 萬，我國AD患者已達(dá)到600余萬，居世界首位，AD病程時(shí)間長(zhǎng)且目前尚無徹底根治的藥物， 它嚴(yán)重威脅著人類的健康，給患者及家屬帶來巨大的影響。因此建立理想及可靠的AD動(dòng)物 模型，對(duì)于研宄和探討AD的病因、病理過程以及尋找和篩選有效藥物顯得尤為重要。
[0003] Αβ是由淀粉樣前體蛋白經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的含有39~ 43個(gè)氨基酸的多肽，A β的大量沉積，是導(dǎo)致AD病人腦內(nèi)老年斑周邊神經(jīng)元變性和死亡的 主要原因。Αβ在腦內(nèi)有多種存在形式，如：低分子量Αβ單體、Αβ寡聚體、不溶性Αβ纖 維體等。Αβ單體是可溶性的低分子物質(zhì)，但是當(dāng)胞內(nèi)環(huán)境，如pH、溫度、離子濃度、蛋白濃 度等改變時(shí)會(huì)誘發(fā)Αβ單體快速聚集，形成二聚體、三聚體或可溶性的Αβ寡聚體，Αβ寡 聚體的穩(wěn)定性較差，易向Αβ纖維體轉(zhuǎn)化。Αβ的種類分為Αβ 1-39、Αβ 1-40、Αβ 1-41、 Αβ 1-42和Αβ 1-43,其中Αβ 1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研宄Αβ 1-42 是當(dāng)前的熱點(diǎn)。
[0004] 近年來，有科學(xué)家提出，Aβ纖維體與記憶損害及神經(jīng)細(xì)胞缺乏的關(guān)系不大，推測(cè) Αβ寡聚體、低分子量Αβ單體等可溶性Αβ可能是AD的致病因素。科學(xué)家們對(duì)Αβ 1-42 寡聚體做了很多研宄，在建立模型時(shí)一般普遍采用A β 1-42寡聚體直接注射方法，但目前 制備、合成Αβ 1-42的寡聚體均不穩(wěn)定，體外容易隨機(jī)形成各種高分子量或低分子量的混 合產(chǎn)物，這種組分不均一的復(fù)雜混合物直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，造成無法 區(qū)分是A β 1-42寡聚體（oligomers)抑或是A β 1-42寡聚體與單體（Monomers)的共同作 用。但現(xiàn)有技術(shù)對(duì)A β 1-42單體極少有報(bào)導(dǎo)，因此，制備成分較單一、穩(wěn)定的A β 1-42單體， 可為AD的發(fā)病機(jī)制、病理過程、尋找和篩選有效藥物提供有效依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種新合成的A β 1-42單體及其制備、鑒定方法。本發(fā)明 提供的A β 1-42單體成分較單一、產(chǎn)物較穩(wěn)定，在建立動(dòng)物模型時(shí)，能將A β 1-42單體作為 對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組，從而對(duì)模型的評(píng)價(jià)更為客觀與科學(xué)，為建立理想和可靠的AD模型提供良 好的基礎(chǔ)；其制備方法簡(jiǎn)單、收率高、省時(shí)；所采用的SDS-PAGE結(jié)合蛋白免疫印記鑒定方 法，具有敏度高、特異性強(qiáng)、方便快速、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種A β 1-42單體，所述的A β 1-42單體主要為單體和少量寡聚體的混合物；所述 單體經(jīng)蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為4-4. 5KD ;所述寡聚體經(jīng)蛋白免疫印記法電泳 鑒定：分子量為12-16KD，為三聚體和四聚體。
[0008] 以上所述A β 1-42單體，所述的A β 1-42單體的制備方法為：取A β 1-42合成肽， 在室溫下完全溶解在HFIP中，所得溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，用干浴氮吹儀使HFIP徹底吹干； 加入DMSO使離心管底部的固體完全溶解，再加入HEPES緩沖液，混勻；在溫度為37°C條件 下震蕩24小時(shí)，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，即得。
[0009] 以上所述Aβ 1-42單體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1.將Img的Αβ 1-42合成肽，加入220-225 μ L HFIP中，在室溫下靜置30-60分 鐘，得到完全溶解的溶液；
[0011] 2.將步驟1得到的溶液轉(zhuǎn)移到硅化的離心管中，在干浴氮吹儀上吹8-15分鐘，使 HFIP徹底吹干，得到透明片狀固體沉于管底；
[0012] 3.在所述離心管中加入40 μ I DMSO,使離心管底部的固體完全溶解，再加入pH值 為7. 4的濃度為IOmM HEPES緩沖溶液，使溶液最后終體積為lml，混合均勻；
[0013] 4.將步驟3得到的溶液在溫度為37°C條件下震蕩24小時(shí)，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，即 得。
[0014] 一種以上所述A β 1-42單體的鑒定方法，包括以下步驟：
[0015] I. SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳：取A β 1-42單體溶液2 μ L，與18 μ L 4Χ電泳上樣緩 沖液混合均勻，然后上樣，電泳上樣量為5ul/泳道，電泳用的膠為4 - 12%的梯度膠，同時(shí) 在一個(gè)泳道加入10 μ L分子量為3. 6-260KD的預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)品，電泳時(shí)選擇80V電壓電 泳30-40分鐘，然后轉(zhuǎn)IOOv電壓繼續(xù)電泳2小時(shí)；
[0016] 2.轉(zhuǎn)膜：將電泳好的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，半干法轉(zhuǎn)膜，時(shí)間為6分鐘，將 轉(zhuǎn)好的PVDF膜按加樣泳道的大小裁剪，然后將剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分 鐘；
[0017] 3.封閉：再將PVDF膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，搖床上慢速振蕩， 轉(zhuǎn)速可為65-75轉(zhuǎn)/分鐘，室溫條件下封閉1小時(shí)；
[0018] 4.洗膜：將步驟3得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗2-3次， 每次5分鐘；
[0019] 5. -抗孵育：將步驟4得到的PVDF膜浸泡在含有6Ε10的一抗溶液中，室溫下孵 育1小時(shí)；
[0020] 6.洗一抗膜：將經(jīng)過一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6 次，每次5分鐘；
[0021] 7.二抗孵育：將漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中 室溫下孵育1小時(shí)；
[0022] 8.洗二抗膜：將經(jīng)過二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6 次，每次5分鐘；
[0023] 9.化學(xué)發(fā)光曝光：將HRP底物液均勻加在經(jīng)步驟8漂洗過的PVDF膜上，在5-30秒 內(nèi)分別進(jìn)行暗室曝光顯影，從中選擇條帶清晰的膠片作為最后結(jié)果。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：
[0025] 1.本發(fā)明提供的A β 1-42單體成分較單一，主要含有分子量為4-4. 5KD的單體，純 度為75%以上，另含有少量分子量為12-16KD的寡聚體；A β 1-42單體較穩(wěn)定，4°C條件下， 其分子量在8小時(shí)內(nèi)基本不變。在建立動(dòng)物模型時(shí)，能將本發(fā)明Aβ 1-42單體作為對(duì)照組 或?qū)嶒?yàn)組，從而對(duì)模型的評(píng)價(jià)更為客觀、科學(xué)，為建立理想和可靠的AD模型提供良好的物 質(zhì)基礎(chǔ)。
[0026] 2.本發(fā)明Αβ 1-42單體的制備方法簡(jiǎn)單、收率高、省時(shí)、成本低；選用HEPES緩沖 溶液，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的PH范圍，與F12等緩沖液相比取得更好的緩沖效果。
[0027] 3.采用SDS-PAGE結(jié)合蛋白免疫印記法鑒定本發(fā)明Αβ 1-42寡聚體，該方法不僅能 檢測(cè)Αβ 1-42單體或寡聚體分子量的大小，同時(shí)還可以檢驗(yàn)Αβ 1-42單體或寡聚體的純度， 與酶聯(lián)免疫吸附法、流式熒光技術(shù)、透射電子顯微鏡觀察相比，具有敏度高、特異性強(qiáng)、方便 快速、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低、圖像清晰、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，克服了當(dāng)前蛋白免疫印記法存在的 蛋白質(zhì)變性、背景過高、電泳過程中出現(xiàn)"拖尾"現(xiàn)象、陽性條帶很弱等問題。
[0028] 4.本發(fā)明整個(gè)檢測(cè)過程均在室溫下進(jìn)行，減少加熱、冷卻等步驟，簡(jiǎn)化了整個(gè)操作 過程；一抗與二抗都是來源于鼠，其匹配性極好、濃度適宜、不會(huì)與封閉劑有交叉反應(yīng)、二抗 不會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合、一抗中含有6Ε10,檢測(cè)過程中不會(huì)出現(xiàn)背景高、陽性條帶很弱等現(xiàn) 象。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例1、2得到的Αβ 1-42單體的蛋白免疫印跡圖。
[0030] 圖2為