μ L (10 μ mol/L)，探針 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，緩沖液 29. 5 μ L，模板 cDNA 14 1^，用(1(1!120 12.4 4 1^將上述混合液加入到含有凍干酶粉的0.21111^￥18七41即11；1；'〇八聯(lián)反 應(yīng)管中，用移液器反復(fù)吹打直到完全溶解。最后加入2. 5yL的醋酸鎂（280mmol/L)啟動反 應(yīng)。38°C 4min，混勻后，再 38°C 20min。
[0081] 每個梯度的模板濃度做三個重復(fù)，通過RPA側(cè)流層析試紙條檢測，驗證RPA側(cè)流層 析試紙條方法的批內(nèi)重復(fù)性；另外，每間隔2d重復(fù)一次，共進(jìn)行3次重復(fù)，驗證RPA側(cè)流層 析試紙條方法的批間重復(fù)性。所獲得的RPA產(chǎn)物分別進(jìn)行側(cè)流層析試紙條檢測。結(jié)果表明， 2B引物探針組可檢測到的5TCID 5Q的cDNA，見圖2。
[0082] 2. RPA側(cè)流層析試紙條檢測方法的特異性分析
[0083] 參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取牛傳染性鼻氣管炎病毒和豬皰瘆病毒 的DNA ;提取牛腸道病毒、牛流熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、豬瘟病毒RNA， 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。
[0084] 按照上述步驟建立的2B引物探針組的RPA方法進(jìn)行特異性試驗，分別以A型、0 型、Asial型口蹄疫病毒的cDNA、牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA、牛腸道病毒cDNA、牛流熱病毒 cDNA、牛病毒性腹瀉病毒cDNA、水痕性口炎病毒cDNA、豬痕病毒cDNA、豬痕疼病毒的DNA為 模板，以CldH 2O為陰性對照，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，試驗重復(fù)3次。
[0085] 所有的RPA產(chǎn)物進(jìn)行側(cè)流層析試紙條檢測，如圖3所示，1 :0型口蹄疫病毒；2 :A 型口蹄疫病毒；3 :Asia 1型口蹄疫病毒；4 :標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒；5 :牛腸道病毒；6 :牛流熱病毒； 7 :牛病毒性腹瀉病毒；8 :水皰性口炎病毒；9 :豬瘟病毒；10 :豬皰瘆病毒；11 :牛傳染性鼻 氣管炎病毒；12 :ddH20。從圖中可以看出，1~4試紙條在檢測區(qū)有陽性條帶和質(zhì)控條帶， 而5-12則無陽性檢測條帶，僅有質(zhì)控條帶，證實所優(yōu)化的2B引物、探針組擴(kuò)增口蹄疫病毒 特異性好，與其它檢測病毒無交叉反應(yīng)。因此，經(jīng)優(yōu)選出的口蹄疫病毒通用引物2BF、2BR和 探針2BP，用于建立檢測口蹄疫病毒的RPA側(cè)流層析試紙條方法，適用于鑒定未知樣本是否 存在口蹄疫病毒的核酸。
[0086] 實施例4 :RPA側(cè)流層析檢測試劑盒的組裝與靈敏度、重復(fù)性試驗
[0087] 將引物2BF和2BR各200 μ L、探針2BP 60 μ L混合，分裝50 μ L/管，作為引物探針 液；然后與標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、緩沖液、酶擴(kuò)增八聯(lián)管、無菌雙蒸水、反應(yīng)驅(qū)動液、側(cè)流免疫層析 試紙條、產(chǎn)物稀釋液組裝成RPA側(cè)流層析檢測試劑盒。
[0088] 利用所組裝的RPA側(cè)流層析檢測試劑盒，按實施例3中的5TCID5(I口蹄疫病毒進(jìn) 行靈敏度檢測，反應(yīng)體系為：引物探針液4. 6 μ L，緩沖液29. 5 μ L，模板cDNA 1 μ L，CldH2O 12. 4 μ L，將上述混合液加入到酶擴(kuò)增八聯(lián)管中，用移液器反復(fù)吹打直到完全溶解。最后加 入2. 5yL的反應(yīng)驅(qū)動液啟動反應(yīng)。38°C4min，混勻后，38°C20min。做三個重復(fù)，取IyL 的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物用49 μ L的產(chǎn)物稀釋液稀釋，側(cè)流免疫層析試紙條進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所 組裝的RPA側(cè)流層析檢測試劑盒可檢測到的5TCID5(I 口蹄疫病毒cDNA，試驗重復(fù)3次，結(jié)果 見圖4。
[0089] 實施例5:臨床樣本的檢測
[0090] 1.樣本的處理
[0091] 采集感染疑似口蹄疫病毒牛的流涎、水皰液等拭子樣本及血液、血清、氣溶膠等樣 本，拭子樣本浸于500 μ L的含PBS溶液的離心管中，反復(fù)擠壓、攪拌，取出上清液于新的離 心管中，置于冰上備用。
[0092] 2.磁珠法快速提取總RNA
[0093] (1)在1.5mL無核酸酶的離心管中加入20yL蛋白酶K、3yL Carrier RNA和 15 μ L磁珠懸液G，加入300 μ L緩沖液RLCK，再加入200 μ L的處理后的樣本上清液\血液 \血清等，移液器混勻。
[0094] (2)室溫孵育lOmin，期間每3min上下顛倒混勻，使磁珠與核酸充分混合。
[0095] (3)將離心管置于磁力架上lmin，小心去除液體，加入500 μ L漂洗液PW I，混勻， 磁力架上靜置30sec，去除液體；再加入500 μ L漂洗液PW II，混勻，磁力架上靜置30sec， 去除液體；然后再重復(fù)用PW I和PW II各洗1次，磁力架靜置30sec，盡量去除液體。
[0096] (4)將離心管置于磁力架，晾干5-10min。
[0097] (5)取下離心管，加入50 μ L無 RNAase的雙蒸水，震蕩混勾，56°C孵育2min，磁力 架上靜置2min，待磁珠完全吸附時小心將核酸溶液轉(zhuǎn)移至新管中，置于冰上備用。
[0098] 3.反轉(zhuǎn)錄制備cDNA
[0099] 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，5XRT buffer 2 μ L、隨機(jī)引物1 μ L、AMV反 轉(zhuǎn)錄酶I UL、粗提的RNA 6 yL。30°C 10min，42°C 30min，95°C 5min，將反應(yīng)管置于冰上。
[0100] 4.臨床樣本的檢測
[0101] 待測樣本為經(jīng)本實驗室利用熒光定量方法檢測過陽性流涎、鼻拭子等樣本17份 和4份陰性樣本。利用磁珠法快速提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以提取的21份樣本的cDNA分 別為模板，以陽性質(zhì)粒為陽性對照、CldH 2O為陰性對照，利用實施例4組裝的RPA側(cè)流層析檢 測試劑盒進(jìn)行檢測。引物探針液4.6 μ L，緩沖液29. 5 μ L，模板cDNA IyUddH2O 12. 4 μ L， 將上述混合液加入到酶擴(kuò)增八聯(lián)管中，用移液器反復(fù)吹打直到完全溶解。最后加入2. 5 μ L 的反應(yīng)驅(qū)動液啟動反應(yīng)。38°C 4min，混勻后，38°C 20min。取1 μ L的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物用49 μ L 的產(chǎn)物稀釋液稀釋，側(cè)流免疫層析試紙條進(jìn)行檢測。若試紙條的檢測區(qū)出現(xiàn)陽性檢測條帶， 則待測樣本中含有口蹄疫病毒；若試紙條的檢測區(qū)未出現(xiàn)陽性檢測條帶，待測樣本中沒有 口蹄疫病毒。
[0102] 經(jīng)RPA側(cè)流層析檢測試劑盒檢測，呈陽性的17份，呈陰性的樣本4份，說明樣品中 有17份為口蹄疫病毒陽性，4份樣品為口蹄疫病毒陰性，即不含有口蹄疫病毒，見圖5。其 中陽性樣本1、4、9為氣溶膠收集液，2、3、7為流涎，5、6為水皰液，8、IO、11為血液，12、13為 血清，14、17為奶樣，15、18為鼻拭子樣本，16為陽性質(zhì)粒，19-22分別為陰性的氣溶膠、血 液、血清、奶樣樣本，23為ddH 20。將此結(jié)果與本實驗室的SYBR Green I熒光定量PCR檢測 結(jié)果對照，結(jié)果完全一致。
【主權(quán)項】
1. 一種用于通過RPA-側(cè)流層析技術(shù)檢測口蹄疫病毒的通用引物和探針組合，其特征 在于，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列 如 SEQ ID No. 3 所示。2. 權(quán)利要求1所述的引物和探針組合在制備檢測口蹄疫病毒的檢測試劑中的應(yīng)用。3. -種檢測口蹄疫病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含由權(quán)利要求1所述的引 物和探針組成的引物探針液。4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述引物探針液的組成為：正向引物和反 向引物終濃度均為〇? 4 ymol/L，探針的終濃度為0? 12 ymol/L〇5. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括有：標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒、緩沖 液、酶擴(kuò)增八聯(lián)管、無菌雙蒸水、反應(yīng)驅(qū)動液、產(chǎn)物稀釋液和側(cè)流層析試紙條。6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒是以FMDV基因組cDNA 為模板，由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6擴(kuò)增的核苷酸片段，與pEASY-Tj^體相連接后得 到的重組質(zhì)粒。7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO. 7 所示。8. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 y L :10XPCR Buffer II 5 y L、2. 5mM dNTP Mixture 8 y L、rTaq 0? 5 y L、cDNA 模板 2 y L，10 y mol/L 的 引物FMDV-F和FMDV-R各2 y L，滅菌超純水加至50 y L。9. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性3min，然后 94°〇2〇8,551：2〇8,721：2〇8,35個循環(huán) ；721：延伸5111111，41：保存。10. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，每50 yL擴(kuò)增體系中含有緩沖液 29. 5 y L、引物探針液4. 6 y L、無菌雙蒸水12. 4 y L、待測樣本cDNA或陽性對照分別為I y L 或空白對照I y L、反應(yīng)驅(qū)動液2. 5 y L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于通過RPA-側(cè)流層析技術(shù)檢測口蹄疫病毒的通用引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探針序列如SEQ ID No.3所示。本發(fā)明還公開了用于口蹄疫病毒檢測的試劑盒。采用本發(fā)明的引物和探針進(jìn)行檢測，僅需通過對臨床樣品進(jìn)行病毒RNA的提取，以及一步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行等溫擴(kuò)增，不需要熱循環(huán)反應(yīng)，不必在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果可在側(cè)流層析試紙條上清晰顯示，具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)程序簡單、檢測時間短等優(yōu)點，適用于牛場快速、準(zhǔn)確、簡便的進(jìn)行口蹄疫病毒的檢測。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
【公開號】CN104946795
【申請?zhí)枴緾N201510292514
【發(fā)明人】王洪梅, 何洪彬
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月1日