一種檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病主要是由結(jié)合分枝桿菌復(fù)合體（M. tuberculosis complex，MTC)引起 的一類以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性人獸共患病。MTC主要由核酸組成高度相似但宿主、 表型和致病性等差異明顯的不同種群組成：結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis,非洲分枝 桿菌M. africanum,肯尼迪分枝桿菌M. canettii,牛分枝桿菌M. bovis,田鼠分枝桿菌 M. microti,海豹分枝桿菌M. pinnipedii以及羊分枝桿菌M. caprae。在中國，每年結(jié)核病新 發(fā)病例大約是100萬，大約占到了全球新發(fā)病例的十分之一（http://www. chinacdc. cn/)。 因此，特異、快速、高效地檢測出MTC不僅可以盡快的給患者準(zhǔn)確的診斷同時從流行病控制 的角度有利于控制和阻止結(jié)核病（國家法定乙類傳染?。┰谌巳旱牧餍?。
[0003] MTC幾乎可以感染人類的任何組織和器官，其中最常見的是肺。病人通常是有較密 切的結(jié)核病接觸史后出現(xiàn)呼吸道咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難而入院 就醫(yī)。通過影像學(xué)及痰液或者胸腹水中的MTC檢測診斷肺結(jié)核。當(dāng)MTC感染肺以外的其他 組織或者器官包括：淋巴結(jié)、消化道、關(guān)節(jié)和滑膜、（支）氣管、腎臟、胸膜和胸壁、鼻（咽） 部、腹腔、骨等，其與宿主組織反應(yīng)出現(xiàn)肉芽腫結(jié)節(jié)，外科手術(shù)后送檢病理診斷。
[0004] 在常規(guī)病理診斷中，要確診結(jié)核病，除了觀察到以肉芽腫為特征的組織學(xué)改變外， 還需找到直接病原菌一 MTC。目前我國病理科開展得最廣泛的尋找病原菌的方法為齊-尼 氏抗酸特殊染，但是齊-尼氏抗酸有其突出的幾大問題比如：陽性率普遍偏低，國際報道普 遍低于10% ;另外，抗酸染色不能從形態(tài)上區(qū)分開MTC和其他的非結(jié)核分枝桿菌（NTM)，造 成誤診。
[0005] PCR檢測時一種較為簡便、準(zhǔn)確的方法，但是目前所有基于PCR技術(shù)的結(jié)核臨床檢 測試劑盒都是針對新鮮樣本（體液、血液等），而MTC感染后僅存留在局部組織中，如肉芽腫 結(jié)節(jié)中，直接取新鮮的體液、血液或者組織時，很多時候會因為選取的組織中不含MTC而造 成假陰性結(jié)果。
[0006] 將組織制成石蠟切片組織后，可以有效確定哪些部位有肉芽腫結(jié)節(jié)，因此通過檢 測肉芽腫結(jié)節(jié)的組織是否含有MTC，可以準(zhǔn)確的確定是否感染MTC，降低假陰性結(jié)果。但是 石蠟組織有其自身的特點，比如其組織中DNA均不是完整的DNA是片段化DNA，其大小一般 小于500bp，另外石蠟組織中，MTC均夾雜在宿主細胞中，難以富集，提取到的DNA絕大多數(shù) 是宿主DNA，待檢的MTC的DNA往往含量很低，因此用常規(guī)檢測新鮮樣本的PCR方法難以有 效檢測。
[0007] 專利號為US7, 332, 597B的專利申請公開了一種檢測石蠟切片組織中MTC的方法， 但是該方法的靈敏度低，MTC的最低檢測限為400fg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù) 合體的試劑盒和方法。
[0009] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1~2與SEQ ID NO. 3~4所示的引物對。
[0010] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的探針。
[0011] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 1~2和/或SEQ ID NO. 3~4所示的引物對以及 SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 6所示的探針在制備檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù) 合體的試劑中的用途。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的試劑盒，它包括 SEQ ID NO. 1~2和/或SEQ ID NO. 3~4所示的引物對以及SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 6所示的探針。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測石蠟切片組織中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的方法，它包括如 下步驟：
[0014] (1)提取樣本DNA :取待檢石蠟切片組織，提取其中的DNA ;
[0015] (2)基因擴增：用權(quán)利要求3所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進行擴增；
[0016] (3)結(jié)果檢測：對DNA擴增結(jié)果進行檢測。
[0017] 本發(fā)明提供的試劑盒可以準(zhǔn)確檢測石蠟切片組織中是否有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體， 且靈敏度高，MTC的最低檢測限為10fg，特異性好，檢測快速，臨床應(yīng)用前景良好。
[0018] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0019] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0020] 圖1是中國食品藥品鑒定研宄院提供人結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv經(jīng)過福爾馬林固定石 蠟處理后，在不同濃度下本發(fā)明與商品化新鮮樣本結(jié)核檢測試劑盒（進口）對比實驗。P表 示弱陽性參照，N是陰性參照，1待檢菌株H37Rv DNA濃度在IOfg條件下，用本發(fā)明方法和 試劑盒檢測的結(jié)果，2表示待檢菌株H37Rv DNA濃度在IOfg條件下，用商品化新鮮樣本結(jié)核 檢測試劑盒（進口）檢測的結(jié)果；
[0021] 圖2是中國食品藥品鑒定研宄院提供人結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv經(jīng)過福爾馬林固定石 蠟處理后，在不同濃度下本發(fā)明與商品化新鮮樣本結(jié)核檢測試劑盒（進口）對比實驗。P表 示弱陽性參照，N是陰性參照，1待檢菌株H37Rv DNA濃度在100f g條件下，用本發(fā)明方法和 試劑盒檢測的結(jié)果，2表示待檢菌株H37Rv DNA濃度在IOOfg條件下，用商品化新鮮樣本結(jié) 核檢測試劑盒（進口）檢測的結(jié)果；
[0022] 圖3是中國食品藥品鑒定研宄院提供人結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv經(jīng)過福爾馬林固定石 蠟處理后，在不同濃度下本發(fā)明與商品化新鮮樣本結(jié)核檢測試劑盒（進口）對比實驗。P表 示弱陽性參照，N是陰性參照，1待檢菌株H37Rv DNA濃度在1000 fg條件下，用本發(fā)明方法 和試劑盒檢測的結(jié)果，2表示待檢菌株H37Rv DNA濃度在1000 fg條件下，用商品化新鮮樣本 結(jié)核檢測試劑盒（進口）檢測的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023] 實驗試劑：
[0024] PCR 反應(yīng)液（貨號 R007A)、dUTP、MgCl2、UNG 酶、Taq 酶，均購自大連 Takara 公司； 石蠟組織提取試劑盒，購自Qiagen公司。
[0025] 實施例1本發(fā)明檢測試劑盒和檢測方法
[0026] 一、本發(fā)明試劑盒的組成
[0027] PCR擴增試劑（50人份）：
[0028]
[0029] Primer 1 :上游引物（F)為：5'-TGG CCA TGC TCT TGA TGC-3'（SEQ ID NO. 1);下 游引物（R)為：5' -CAA ACA AAA CCC AAA CAC TCC C-3'（SEQ ID NO. 2);
[0030] FAM 標(biāo)記的 Taqman 熒光探針 1 引物序列為 5' -CAGGATATTTCTAAATACCTTTGGCTCCCT -3' (SEQ ID NO. 5)；
[0031] Primer 2 :上游引物（F)為：5'-GACCTACTACGACCACATCAA-3'（SEQ ID NO. 3);下游 引物（R)為：5'-TCAGGGTTAGCCACACTTT-3'（SEQ ID N0.4);
[0032] FAM 標(biāo)記的 Taqman 熒光探針 2 引物序列為：5' -ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCA-3 (S EQ ID NO. 6) 〇
[0033] 二、采用本發(fā)明試劑盒檢測
[0034] 1、樣本DNA提?。嚎梢允褂肣iagen公司、天根公司、Promega公司等
[0035] 石蠟組織提取試劑盒，本例以Qiagen公司為例，提取DNA :
[0036] 利用手術(shù)刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0037] 將石蠟包埋組織切成4 μ m厚的薄片；
[0038] 迅速用滅菌小鑷子取2-6枚裝入DNase/RNase Free EP管中（每張攤開面積 500 (最大）mm2，即邊長I. 6cm的正方形大小；
[0039] 加入800 μ 1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)