分離的家族性高甘油三酯血癥疾病的lpl新突變致病基因及檢測(cè)該基因的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分離的家族性高甘油三酯血癥疾 病的LPL新突變致病基因及檢測(cè)該基因的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 家族性乳糜血綜合征（familial chylomicronemia syndrome，F(xiàn)CS，在本文中也可 稱為高甘油三酯血癥）是一種罕見的常染色體隱性遺傳性代謝缺陷，表現(xiàn)為患者體內(nèi)缺乏 脂蛋白脂肪酶，使血液中的甘油三酯和乳糜微粒濃度升高。脂蛋白脂酶缺乏病癥十分罕見， 每百萬(wàn)人中約有一到兩例患者，患者體內(nèi)的血液無(wú)法承受任何脂肪顆粒，而且這類患者在 飲食方面禁食正常餐飲，因?yàn)榛颊呷菀壮霈F(xiàn)各種急性胰腺癌病癥。其主要特點(diǎn)是：嚴(yán)重的高 甘油三酯血癥伴隨以下一個(gè)或多個(gè)臨床癥候群：1.孩童時(shí)期伴隨腹痛出現(xiàn)的高三酸甘油 血癥；2、反覆發(fā)作的急性胰臟炎；3、皮膚上發(fā)瘆般的黃色瘤；4、肝脾腫大。
[0003] 家族性高乳糜微粒血癥是起因于脂蛋白脂肪酶（LPL)功能低下或不良，LPL是LPL 基因的產(chǎn)物，在染色體上的位置是8p22。LPL對(duì)于飲食中長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝至關(guān)重要。通常， 這些長(zhǎng)鏈脂肪酸被包裝到甘油三酯中，幫助將脂類從腸運(yùn)送到其他組織，隨后LPL將甘油 三酯分解為細(xì)胞能夠處理的大小。在LPLD患者體內(nèi)，LPL不能分解甘油三酯。因此，細(xì)胞 吸收飲食脂肪不良，使其仍然停留在血液中。一般來(lái)說(shuō)，在用餐后，乳糜隔夜就應(yīng)該會(huì)在血 漿中廓清。家族性高乳糜微粒血癥患者體內(nèi)，因?yàn)檠獫{中乳糜微粒廓清的功能受到損害，會(huì) 導(dǎo)致三酸甘油脂堆積在血漿中而使得血漿看起來(lái)像牛乳一般。
[0004] 家族性高甘油三脂血癥可在10歲前就發(fā)生急性胰腺炎?；颊咭认傺追磸?fù)發(fā)作，非 常痛苦，有時(shí)通常以少量安全形式分泌的消化酶會(huì)一次激活，開始消化胰腺和周圍組織，從 而危及生命。FCS患者還有著異常高的血脂水平，使得他們易患早發(fā)性糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬 化。
[0005] 到目前為止，通過(guò)測(cè)序篩選已經(jīng)確定了 LPL、AP0C2、AP0A5, GHIHBP1，LMFl等的突 變均可導(dǎo)致甘油三酯代謝異常。其中以LPL相關(guān)突變位點(diǎn)就已達(dá)70余個(gè)基因位點(diǎn)。但是盡 管現(xiàn)有的關(guān)于FCS的致病機(jī)理方面的研宄已經(jīng)較前有明顯清晰，但仍存在著相當(dāng)一部分未 知致病基因位點(diǎn)。已知對(duì)于未知致病基因的研宄有利于對(duì)家族性乳糜血綜合征的診斷提供 可靠依據(jù)，還有可能作為治療家族性乳糜血綜合征的藥物標(biāo)靶，用于篩選易感家族性高甘 油三酯血癥的生物樣品的試劑盒以及篩選治療或預(yù)防家族性高甘油三酯血癥疾病的藥物， 因此，對(duì)家族性高甘油三酯血癥疾病的研宄對(duì)研發(fā)治療或預(yù)防家族性乳糜血綜合征的藥物 具有很重要的作用。
[0006] 由此可見，能否進(jìn)一步研宄FCS的致病機(jī)理，找出分離的家族性高甘油三酯血癥 疾病的LPL新突變致病基因成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種分離的家族性高甘油三酯血癥疾病的 LPL新突變致病基因及檢測(cè)該基因的試劑盒。本發(fā)明通過(guò)Sanger法測(cè)序驗(yàn)證方法確定的家 族性高甘油三酯血癥的致病基因上的新突變。LPL基因的多個(gè)突變位點(diǎn)已經(jīng)在其他發(fā)表的 文章中被證實(shí)與FCS相關(guān)，但本次發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)為新的，在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0009] -種分離的家族性高甘油三酯血癥疾病的LPL新突變致病基因，所述LPL新突變 致病基因的核酸樣本的核苷酸序列與編碼野生型LPL蛋白的基因，如SEQ ID ΝΟ:1所示的 核苷酸序列相比，第928位堿基發(fā)生OT的突變，所述LPL突變致病基因的核酸樣本為人工 分離或合成的單鏈DNA、雙鏈DNA、RNA或DNA與RNA的聚合物。
[0010] LPL基因的新突變基因與原發(fā)性結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，從而通 過(guò)檢測(cè)該新突變基因在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易感家族性高 甘油三酯血癥，也可以通過(guò)檢測(cè)這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體 是否易感家族性高甘油三酯血癥。
[0011] 一種分離的家族性高甘油三酯血癥疾病的LPL新突變體多肽，其氨基酸序列與 SEQ ID N0:2相比，具有P.C310R突變，即343位的Y突變?yōu)镈。該多肽是由前述分離的編 碼LPL突變體的核酸編碼的。通過(guò)檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè)生物 樣品是否易感家族性高甘油三酯血癥，也可以通過(guò)檢測(cè)這些多肽在生物體中是否存在，可 以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易感家族性高甘油三酯血癥。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)Sanger外顯子測(cè)序和基因突變驗(yàn)證的方法確定了家族性高甘油三酯 血癥新的致病基因突變（NM_〇〇〇237. 2:c. 928C>T NP_000228. l:p. C310R)。LPL基因突變基 因，其與SEQ ID NO :1相比，該核酸具有p.C310R突變。在本文中所使用的表達(dá)方式"編碼 LPL突變體的核酸"，是指與編碼LPL突變基因相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別 限制，可以是任何包含與LPL突變體的編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷 酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。優(yōu)選地，所述的編碼LPL突變基因的核酸樣 本為DNA。
[0013] 野生型LPL基因的m RNA序列具有1468nt，翻譯后的LPL蛋白質(zhì)含有475個(gè)氨基 酸，具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的新突變體與SEQ ID NO :1相比，具 有p. C310R突變，即相對(duì)于野生型LPL蛋白的基因，本發(fā)明的LPL基因突變基因的cDNA中 第928位的T突變?yōu)镃，由此，其所編碼的產(chǎn)物與野生型LPL蛋白（SEQ ID N0:1)相比，具 有p. C310R突變，即343位的Y (酪氨酸）突變?yōu)镈 (天冬氨酸）。
[0014] 已知，LPL基因所編碼全長(zhǎng)28. 188kp，包含10個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物為475個(gè)氨基酸 的蛋白質(zhì)，在脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用，基于一些早期的LPL同源模型的分析和體內(nèi)體 外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，很多氨基酸的缺失和替代導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄蛋白嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)變化，酶活性的喪失，影響 LPL的活性，使其不能發(fā)揮正常的功能。
[0015] 一種篩選易感家族性高甘油三酯血癥的生物樣品的方法，包括以下步驟：從所述 生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO :1相比，具有p. C310R突變是所述生物樣品易感家族性高甘油三酯血癥疾病的指示。
[0016] 所述的生物樣品可以為選自人體血液、皮膚、皮下組織中的至少一種。
[0017] 所述核酸樣本為從生物樣品中直接提取的全基因組DNA、全基因組中包含LPL編 碼序列的一部分、從生物樣品中提取的總RNA或從生物樣品中提取的mRNA中的任一種。
[0018] 確定所述核酸樣本的核酸序列的方法為，先設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增LPL外顯子的特異性引 物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。
[0019] LPL外顯子特異性引物的序列不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，這些LPL 外顯子特異性引物具有SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAA TCTTGGTG-3'/5' GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。
[0020] 一種篩選易感家族性高甘油三酯血癥膜變性疾病的生物樣品的方法。該篩選易感 家族性高甘油三酯血癥的生物樣品的方法可以包括以下步驟：生物樣品提取核酸樣本。生 物樣品的類型并不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生物樣品LPL是否存 在突變的核酸樣本即可。生物樣品可以為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種。由此， 可以方便地進(jìn)彳丁取樣和檢測(cè)，從而能夠進(jìn)一步提尚篩選易感家族性尚甘油二醋血癥疾病的 生物樣品的效率。這里所使用的術(shù)語(yǔ)"核酸樣本"應(yīng)做廣義理解，其可以是任何能夠反映生 物樣品中