一種歐當歸的檢測試劑盒與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種歐當歸的檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 歐當歸（Levisticum officinale Koch)，又名保當歸，系傘形科歐當歸屬多年生 草本植物。1957年，當歸緊缺時從保加利亞引種，在我國河北、北京、山東、河南、內蒙古、遼 寧、陜西、山西及江蘇等地均有栽培。歐當歸以干燥的根入藥，早為德國藥典所收載，香氣特 異而渾濁，性甘、味微辣、微甘而有麻舌感，具有利尿、健胃、祛痰、治療婦科病等功效，是正 品當歸常見的偽品。
[0003] 由于歐當歸的藥效不及當歸，而且藥理上也有較大的不同，因而不能作為當歸使 用，但是其本身有藥效，而且栽培容易，生長期短。因此，有效鑒別歐當歸，對其進合理使用 是非常必要的。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了克服現有技術的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的、方便、快速、準確地檢測歐當 歸的試劑盒和方法。
[0005] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1所示的種核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了檢測SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備歐當歸檢測試劑 中的用途。
[0007] 所述檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列的試劑。
[0008] 所述歐當歸是傘形科植物歐當歸Levisticum officinalis Koch所述擴增的試劑 包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對。
[0009] 本發(fā)明檢測歐當歸的試劑盒，包括檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相關試劑。
[0010] 所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑。
[0011] 所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對。
[0012] 本發(fā)明一種歐當歸的檢測方法，包括如下步驟：
[0013] a，DNA提?。禾崛〈龣z樣本中的DNA ;
[0014] b，檢測：用前述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
[0015] 本發(fā)明SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列為歐當歸特異性序列，通過檢測這些序列可 以準確區(qū)分歐當歸與當歸、日本當歸，從而有效鑒定待檢樣本是否為歐當歸，為藥材的合 理使用提供指導，本發(fā)明方法操作簡便，具有良好的應用前景。
[0016] 下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明，但是并不是對本發(fā)明的限 制，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，都是本發(fā)明保護的內 容。
【附圖說明】
[0017] 圖1.歐當歸的改良RAH)擴增。箭頭為A13的RPAD片段，用于膠回收和克隆。
[0018] 圖2陽性克隆的菌落PCR鑒定。藍色所指通道的陽性克隆用于Sanger測序。通 道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標記。泳道1-5分別代表不同陽性克隆的菌落。
[0019] 圖3不同物種及當歸品種的鑒定。通道1-18號分別為甘肅岷縣當歸，日本當歸， 四川阿壩當歸，甘肅平涼當歸，湖北當歸，四川九寨當歸，歐當歸，云南麗江當歸，四川綿陽 當歸，銀杏，荔枝，龍眼，青果，金銀花，梔子花，靈芝，龍荔，趕黃草。藍色所指的通道2為日 本當歸，通道7為歐當歸。通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標記。
[0020] 圖4不同歐當歸品種的鑒定。通道1、2和3是日本當歸，分別來自重慶，四川峨眉， 延吉吉林；通道4和5是歐當歸，來自長春吉林和四川甘孜；6是正常岷縣當歸；通道"M"顯 示有分子重量（bp)的DL2000DNA標記。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1 RAPD技術擴增歐當歸特異SCAR標記
[0022] 一、CTAB法提取植物DNA
[0023] 取歐當歸0. 2g置于I. 5mL EP管中，加入液氮約半分鐘后用研缽棒碾碎成細粉，立 即加入 500 μ 1 的 CTAB 提取緩沖液[CTAB2%，Tris-HCl (ρΗ8· 0) IOOmmol · L-1，EDTA20mmol mmol · L-1，NaCL I. 4mol · L-SO. 4%的β -巰基乙醇]，60°C水浴保溫1小時后，加入等體 積的氯仿-異戊醇（24 :1)抽提，輕顛倒混勻，10000轉每分鐘離心10分鐘，吸取上清液，取 上清加入2/3體積的預冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻；12000轉每分鐘離心10分鐘，棄上 清，小心傾去上清液，沉淀用70 %乙醇和無水乙醇各輕洗一次，棄洗液，留沉淀，空氣干燥。 用100 μ 1的IXTE溶液溶解備用。將樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量， 用分光光度計測定濃度，稀釋至濃度IOng/μ 1，-20°C保存?zhèn)溆?。詳見《精編醫(yī)學分子生物 學實驗指導》（中國醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江）。
[0024] 二、RAPD 技術 PCR 擴增
[0025] 利用 RAPD 技術進行擴增（參照 Fu J, Yang L, Khan MA, Mei Z (2〇I3) Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis. Mol Biol Repj40(10):5993-9)：
[0026] 以步驟一提取的核酸作為模板，用RAH)引物SBA-Al和SBS-A2進行擴增（序列見 表1，北京賽百盛公司合成），PCR擴增采用10 μ 1反應體系包括μ 1的引物（2.5 μmol/ L)，1.5yl(15ng)模板DNA，5μ1 的 2XPCR Taq Mastermix(天根生物公司，北京）和 2. 5 μ 1的滅菌雙蒸水。充分混勾后，于離心機12000rpm離心15s，置于PCR儀（Applied Biosystems Vedti? 96-Well Thermal Cycler，Life Technology, USA)。PCR 反應條件是： 95°C I分30秒，94°C 40秒，36度60秒，72°C I分30秒，40個循環(huán)，最后72°C 5分鐘，其中 RAMP為5%。然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，曝光顯色。
[0027] 表 1
[0028]
[0029] 瓊脂糖凝膠電泳（參見《精編醫(yī)學分子生物學實驗指導》，中國醫(yī)藥科技出版社， 主編：傅俊江）：
[0030] (1)制備1. 5%的瓊脂糖凝膠，將PCR產物按順序全部點樣到凝膠孔內，同時點樣 一個DNA分子大小標記（DL2000, TIANGEN公司，北京）。注意：不需要加載樣緩沖液，PCR擴 增用的2Xmix就預加了相關成分。
[0031] (2)電泳（電泳儀由北京百晶生物有限公司生產，BG-subMID Icell)，常選擇電壓 110V，電泳時間30min即可，
[0032] 三、RAPD擴增條帶的分離
[0033] 1.片段回收
[0034] 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下剪切圖正品歐當歸品種的特異片段A1-0,用 DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生物公司）回收RAH)擴增的DNA片段。
[0035] 2.克隆
[0036] 接著利用pGEM-T載體（Promega Corporation)和回收RAPD擴增的DNA片段在 T4-DNA連接酶作用下連接（16°C連接8小時）。連接后加入30 μ 1活化的DH5 α細菌，冰 浴30分鐘，接著42 °C激活45秒，然后冰浴2分鐘，再加入300 μ 1無氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 基（配制方法：12. 5克LB粉加500ml水高溫滅菌）200轉每分鐘搖動45分鐘，然后將液體 均勻涂抹在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)15小時[固體培養(yǎng)基配制方法： 12. 5克LB粉，7. 5克瓊脂粉和500毫升水高溫滅菌后，在50°C時加入500 μ 1的氨芐青霉素 (100mg/ml)，使用前在固體培養(yǎng)基表面涂抹40 μ 1的20mg/ml的X-GAL (5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷）和20 μ 1的24mg/ml的IPTG (異丙基硫代半乳糖苷）]進行藍白篩選， 篩選白色菌落進行菌落PCR鑒定。
[0037] 3.陽性克隆鑒定
[0038] 每個皿挑選多個白色菌落，分別加入到300 μ 1含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 220轉每分鐘搖2-4小時，取0. 2~0. 5 μ 1培養(yǎng)基進行菌落PCR反應。10 μ 1體積的反應 體系是：2XPCR Taq Mastermix 5yl，DNA 0·5μ1，通用引物（SP6+T7)lyl(2.5ymol/L)， 水3. 5 μ 1。PCR反應條件是：95 °C 1分30秒，94°C 40秒，58 °C 30秒，72 °C 40秒，30個循環(huán)， 最后72°C 5分鐘。然后用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色、曝光顯色。
[0039] 4.結果
[0040] 改良RAro擴增見圖1。陽性克隆的菌落PCR擴增和電泳鑒定結果如圖2。
[0041] 五、測序分析
[0042] 1.測序
[0043] 挑選陽性克隆，進行Sanger測序。測序的核苷酸序列如下（SEQ ID NO. 1所示）：
[0044] CTTACTTACCTAAAGTGAACTTTTGGCTTACCTAAAAAGTGGACTGAAGGAACTGACCTAAGCATAGCT CTCTCAAATAAAAATGCCTTTCATTTCTCTTTTAAGACCTTTGTCCTACTTCTAGTCTCAGTCCTCC