3562(系譜為圃浙恢7954X 0504F4)表現(xiàn)為 所有單株高度不育。2008年冬季，帶3個(gè)稻粧在海南省陵水縣浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南繁基地 種植，結(jié)果3個(gè)稻粧抽穗時(shí)發(fā)現(xiàn)雌、雄蕊等花器官形態(tài)正常，雄蕊花藥飽滿(mǎn)，開(kāi)花時(shí)能正常 散粉。經(jīng)I2-KI染色法檢查（參見(jiàn)：減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)耐熱性不同水稻品種產(chǎn)量的影 響及其生理原[J].作物學(xué)報(bào)，2008, 34(12) :2134-2142)花粉育性，均為可育花，但不論是 開(kāi)放的自花授粉，還是人工的飽和授粉，均不能結(jié)種子，經(jīng)過(guò)多次雜合體自交純化后保存種 質(zhì)，命名為水稻雌性不育突變體fmsl (￡enpl sterile mutant 1)。
[0035] 2.突變體的表型
[0036] 2010年夏季，在杭州浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)（30. 14° N，120. Γ E)，種植從海 南省陵水縣南繁基地（30. 14° N，120. Γ E)帶來(lái)的突變體fmsl稻粧，始穗后取樣觀察突 變體穗部性狀、花器結(jié)構(gòu)等的表現(xiàn)型，用LEICA Z16 APOA體視光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡儀器 有限公司生產(chǎn)）觀察并拍照。取少量花藥，用1 %的I2-KI檢測(cè)花粉育性，用Nikon ECLIPSE E600三目顯微攝像系統(tǒng)觀察并拍照統(tǒng)計(jì)。
[0037] 以秈稻9311為母本，突變體fmsl為父本，人工配制9311/fmsl雜交F1，種植Fl表 現(xiàn)為正常結(jié)實(shí)，收獲自交F2,第二年春季在海南省陵水縣南繁基地種植F2群體，觀察并統(tǒng) 計(jì)F2的不育個(gè)體數(shù)和可育個(gè)體數(shù)。隨機(jī)選取若干正常結(jié)實(shí)的F2單株，收獲自交F3種子， 2011年夏季種植F3群體，觀察F3單株種子的結(jié)實(shí)，統(tǒng)計(jì)不育個(gè)體數(shù)和可育個(gè)體數(shù)，經(jīng)X2測(cè) 驗(yàn)檢測(cè)不育個(gè)體數(shù)和可育個(gè)體數(shù)分離比例。
[0038] 在浙恢7954和0504雜交F4中，發(fā)現(xiàn)株系34562所有的單株均不能結(jié)實(shí)。用突變 體fmsl作為父本，給正常野生型材料授粉，雜交后代均能結(jié)實(shí)；相反，以突變體fmsl為母 本，以正常植株花粉進(jìn)行飽和授粉，均不能使突變體結(jié)籽。初步的結(jié)果表明突變體fmsl為 雄性可育而雌性不育的突變體。
[0039] 將突變體fmsl的植株形態(tài)和花器官與其他野生型材料相比較結(jié)果表明，如圖1中 的A、B所示，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，突變體fmsl與秈稻品種9311基本相似；如圖1中的G、H、J 所示，在抽穗期，突變體fmsl花器官正常，有2個(gè)護(hù)穎、1個(gè)外穎、1個(gè)內(nèi)穎、1對(duì)漿片、雄蕊6 枚、6個(gè)花絲和1枚雌蕊（子房），子房上著生2個(gè)正常大小的柱頭。內(nèi)外穎通過(guò)相互嵌合 的鉤合槽關(guān)閉或打開(kāi)小花，2個(gè)衆(zhòng)片位于穎花基部外穎一側(cè)，從形態(tài)上看，fmsl與9311無(wú)明 顯差異；如圖1中的C、D所示，但在成熟期，fmsl無(wú)法產(chǎn)生種子，而9311正常結(jié)實(shí)。
[0040] 3.細(xì)胞學(xué)觀察
[0041] 在9311和fmsl始穗時(shí)，選取穗長(zhǎng)約23. 3cm~26cm的稻穗各20個(gè)，此時(shí)的胚囊 發(fā)育已處于成熟期即胚珠發(fā)育第9期（Ov91)。采用半薄切片方法觀察fmsl與正常植株的 成熟胚囊，比較兩者可能的差異。具體操作步驟如下：
[0042] (1)材料的固定：剝?nèi)バ』ǖ姆f殼，放入2. 5%戊二醛固定液中4°C固定過(guò)夜。用 吸管吸去固定液，用0.1 M pH 7.0的磷酸緩沖液沖洗樣品三次，每次15min。最后用1 %鋨 酸固定1~2h。
[0043] (2)脫水：倒掉固定液，用0.1 M pH7. 0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min。 用梯度濃度（包括50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液脫水各1511^11，然后用100% 乙醇脫水2次，每次20min，最后用純丙酮浸漬處理20min。
[0044] (3)包埋與聚合：用Spurr樹(shù)脂包埋劑與丙酮的混合液（V/V = 1/1)處理樣品lh， 再用包埋劑與丙酮的混合液（V/V = 3/1)處理3h。最后在純包埋劑中處理并過(guò)夜。將處理 的材料放置于盛有純樹(shù)脂包埋劑的包埋管中。用鑷子小心撥動(dòng)樣品使其方向利于縱切，放 入70°C恒溫箱中聚合12h~24h，取出放于干燥器皿中。
[0045] (4)修塊與切片：在LKB 11800切片機(jī)（Pyramitome)上進(jìn)行修塊，切割樹(shù)脂塊，使 樣品稍稍暴露，使待切部位呈長(zhǎng)方形或方形?？v切子房，切片厚度以2μπι為佳。
[0046] (5)貼片和染色：載玻片上滴上蒸餾水，將理想切片漂浮于水面，用 Reichert-Jung ΗΚ120型烘片機(jī)烘干。在切片部位加1~2滴次甲基藍(lán)，再次在烘片機(jī)烤 片，并用蒸餾水洗，再次烘干。
[0047] (IO)Nikon ECLIPSE Ε600三目顯微攝像系統(tǒng)觀察，選取理想的切片記錄與拍照。
[0048] 選取突變體fmsl成熟穎花的花藥，用1 % I2-KI染色，在顯微鏡下觀察形態(tài)和花粉 粒的染色程度，結(jié)果如圖1中的E、F所示，突變體fmsl花粉粒大小與9311相一致，90%以 上的花粉呈深黑色，結(jié)果表明突變體fmsl花粉育性正常。
[0049] 采用樹(shù)脂半薄切片觀察fmsl和9311的胚囊結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1的K、L所示，K是突 變體fmsl成熟胚囊的縱切面，結(jié)果沒(méi)有見(jiàn)到明顯的胚囊結(jié)構(gòu)，L是9311的成熟胚囊的縱切 面，可以觀察到珠孔端的2個(gè)助細(xì)胞和1個(gè)卵細(xì)胞、合點(diǎn)端的3個(gè)反足細(xì)胞及上下兩個(gè)極核 的典型的水稻8細(xì)胞成熟胚囊結(jié)構(gòu)。從胚囊切片觀察的結(jié)果，證實(shí)了突變體fmsl是一個(gè)雌 性不育表型，導(dǎo)致雌性不育的原因是胚囊在較早的時(shí)期發(fā)育停止。
[0050] 4.突變體fmsl的遺傳分析
[0051] 突變體fmsl不能正常結(jié)種子，fmsl與9311和日本晴雜交Fl均表現(xiàn)為正常結(jié)實(shí)， 但F2群體的育性呈明顯的可育與不育的分離。統(tǒng)計(jì)fmsl X 9311的F2群體332株，其中可 育株248株，不育株74株，X2= 0. 5962〈X2Q.Q22. 577,進(jìn)一步隨機(jī)選擇一個(gè)F3群體，312株中 可育株為242株，不育株70株，X2= 0.9615〈X2aQ22.577, X2檢測(cè)都符合3:1(表1)。同樣 統(tǒng)計(jì)fmsl X日本晴的F2和群體F3,群體中可育株和不育株的分離比例，經(jīng)X2檢測(cè)都符合 3:1 (表 1) 〇
[0052] 表1突變體fmsl的遺傳分析
[0053]
[0054] 兩個(gè)組合和兩個(gè)世代的遺傳分析結(jié)果表明，突變體fmsl的雌性不育性狀可能由 一對(duì)隱性核基因控制。
[0055] 實(shí)施例2突變基因的圖位克隆
[0056] 1.定位群體的構(gòu)建
[0057] 將秈稻品種9311和粳稻品種日本晴為母本分別與突變體fmsl雜交得到9311/ fmsl和日本晴/fmsl的Fl，種植Fl于海南省陵水縣浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南繁基地，收獲F2 種子。在杭州浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植F2群體，鑒定群體中的雌性不育株，收取葉 片；同時(shí)收獲正常結(jié)實(shí)的F2單株50多株。第2年春季在海南省陵水縣種植F3群體，分離 并鑒定出雌性不育株?？紤]到秈稻與粳稻雜交也會(huì)產(chǎn)生不育個(gè)體，我們?cè)跇?gòu)建分子定位群 體時(shí)，秈稻品種9311與秈稻背景的突變體fmsl雜交的F2和F3個(gè)體用于基因的初步定位， 因?yàn)槎i/秈雜交Fl不會(huì)出現(xiàn)不育；粳稻品種日本晴和與突變體fmsl雜交，可以獲得更多的 多態(tài)性標(biāo)記，用于FMSl的精細(xì)定位。
[0058] 2. FMSl的初步定位
[0059] 采用CTAB法提取水稻單株葉片的總DNA (參見(jiàn)！Murray M G, Thompson W F, Rapid isolation of high-molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research, 1980, 8:4321-4325)，米用 BSA法（Michelmore 等）（參見(jiàn)：Michelmore R W, Paran I,Kesseli R V,Identification of markers rapid linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1991, 88:9828-9832)，利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的圖位克 隆方法進(jìn)行初定位分析，具體為：隨機(jī)選取20株野生型表型株和20株突變體表型株，提取 DNA分別等量混勻構(gòu)建野生型DNA池和突變型DNA池。實(shí)