HHrpEcc蛋白及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及HHrpEcc蛋白及其編碼基因和應(yīng)用，具體涉 及HHrpEcc蛋白及其編碼基因在促進植物生長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Harpin是一種富含甘氨酸的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，是通過革蘭氏陰性植物致病細 菌中III型分泌系統(tǒng)分泌的。Harpin可以在非寄主植物和抗病植物上激發(fā)過敏性反應(yīng) (hypersensitive response，HR)，在感病寄主上具有致病性（pathogenicity)。當(dāng)在非寄 主植物上使用Harpin時，可以提高植物的抗病抗蟲性，同時它還可以促進植物的生長，從 而提高作物的產(chǎn)量。Harpin主要通過受體及傳導(dǎo)，激發(fā)宿主植物細胞內(nèi)的信號物質(zhì)，同時激 發(fā)植物自身抗病、抗蟲、抗不良環(huán)境的防衛(wèi)系統(tǒng)和生長發(fā)育系統(tǒng)的表達和活力，促進生長發(fā) 育，從而極大增強作物對病毒、細菌、真菌的防御能力。Harpin屬于新型、安全、穩(wěn)定和高效 的生物農(nóng)藥和生長促進劑。
[0003] 如需要大量生產(chǎn)Harpin蛋白，在大腸桿菌中重組表達是非常有效的方法，但 是這些蛋白有很多在大腸桿菌中是以包涵體的形式存在。如來源于Pectobacterium carotovorum的HrpEcc在大腸桿菌中表達主要以包涵體的形式存在，因此在大腸桿菌中可 溶性大量表達Harpin將是非常有用的技術(shù)。
[0004] 目前Harpin蛋白的使用濃度為15-100 μ g/ml，只用在這種高濃度時才能有效的 提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。但是當(dāng)使用較高濃度時Harpin時，將會明顯提高農(nóng)作物的成本，因此 限制其使用。因此需要開發(fā)出更高效的harpin蛋白，降低其使用成本，使其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是獲得高生物活性Harpin蛋白，降低其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中使用成本。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了 HHrpEcc蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，命名為HHrpEcc蛋白，自上游至下游依次包括如下區(qū) 段：HrpNl區(qū)段、HrpW區(qū)段、HrpEcc區(qū)段、1個以上拷貝的HrpN2區(qū)段和HrpzPSS區(qū)段；所述 HrpNl區(qū)段由序列表的序列1自N末端第1-29位氨基酸殘基組成；所述HrpW區(qū)段由序列 表的序列1自N末端第35-83位氨基酸殘基組成；所述HrpEcc區(qū)段由序列表的序列1自N 末端第87-202位氨基酸殘基組成；所述HrpN2區(qū)段由序列表的序列1自N末端第207-246 位氨基酸殘基組成；所述HrpzPSS區(qū)段由序列表的序列1自N末端第395-437位氨基酸殘 基組成。
[0007] 所述"1個以上拷貝的HrpN2區(qū)段"具體可為4個拷貝的HrpN2區(qū)段。
[0008] 所述HHrpEcc蛋白具體可為如下（I )或（II )或（III)或（IV ):
[0009] ( I )序列表的序列1所不的蛋白質(zhì)；
[0010] ( II )在序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋 白質(zhì)；
[0011] (III)序列表的序列3所不的蛋白質(zhì)。
[0012] (IV )將（I )或（II )或（III)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有促進植物生長活性的蛋白質(zhì)。
[0013] 所述標(biāo)簽具體可如表1所示。
[0014] 表1標(biāo)簽的序列
[0015]
[0016] 上述（IV )中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 所述HHrpEcc蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0018] 上述（IV)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列2或序列4所示的DNA序列中缺 失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到。
[0019] 編碼所述HHrpEcc蛋白的核酸分子（HHrpEcc基因）也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0020] 所述核酸分子具體可為如下（1)或（2)或（3)或（4):
[0021] (1)序列表的序列2所示的DNA分子（cDNA或基因組DNA);
[0022] (2)序列表的序列4所示的DNA分子（cDNA或基因組DNA);
[0023] (3)與⑴或⑵限定的DNA分子具有75%以上同一性且編碼所述HHrpEcc蛋白 的DNA分子（cDNA或基因組DNA);
[0024] (4)在嚴格條件下與（1)或⑵限定的DNA分子雜交且編碼所述HHrpEcc蛋白的 DNA分子（cDNA或基因組DNA)。
[0025] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的 方法，對本發(fā)明中的HHrpEcc基因進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明提供的 HHrpEcc基因具有75%以上同一性的核苷酸，只要編碼所述HHrpEcc且具促進植物生長活 性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0026] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的HHrpEcc基因具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多 個序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0027] 上述生物材料中，所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次15min;或，0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0028] 上述75%或75%以上同一性，可為80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0029] 含有所述HHrpEcc基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā) 明的保護范圍。所述重組載體具體如下：將pBAD-hisB載體中Xho I和Pst I酶切位點之 間的小片段替換為序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子，得到重組質(zhì)粒pBAD/HHrpEcc。所 述重組菌具體如下：將重組質(zhì)粒pBAD/HHrpEcc導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含有重組質(zhì) 粒pBAD/HHrpEcc的重組大腸桿菌。
[0030] 本發(fā)明還保護一種制備所述HHrpEcc蛋白的方法，包括如下步驟：發(fā)酵所述重組 菌，得到所述HHrpEcc蛋白。制備所述HHrpEcc蛋白的方法具體包括如下步驟：在含50 μ g/ mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組菌，培養(yǎng)體系的OD6tltlmi值為0. 6-0. 8時加 入阿拉伯糖病使阿拉伯糖在體系中的濃度為〇. 2g/100mL，然后30°C、200rpm/min振蕩培養(yǎng) 14h〇
[0031] 本發(fā)明還保護所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋白在制備植物促生長劑中的應(yīng)用。 所述植物可為十字花科植物，具體可為蕓苔屬植物，更具體可為油菜，例如上海青油菜。所 述植物促生長劑的功能為促進植物生長。所述促進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根系 和/或葉片生長。
[0032] 本發(fā)明還保護所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋白在促進植物生長中的應(yīng)用。所述 植物可為十字花科植物，具體可為蕓苔屬植物，更具體可為油菜，例如上海青油菜。所述促 進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根系和/或葉片生長。
[0033] 本發(fā)明還保護一種植物促生長劑，其活性成分為所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋 白。所述植物可為十字花科植物，具體可為蕓苔屬植物，更具體可為油菜，例如上海青油菜。 所述植物促生長劑的功能為促進植物生長。所述促進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根 系和/或葉片生長。
[0034] 本發(fā)明還保護所述HHrpEcc基因或含有所述HHrpEcc基因的表達盒或含有所述 HHrpEcc基因的重組載體或含有所述HHrpEcc基因的轉(zhuǎn)基因細胞系或含有所述HHrpEcc基 因的重組菌在制備植物促生長劑中的應(yīng)用。所述植物可為十字花科植物，具體可為蕓苔屬 植物，更具體可為油菜，例如上海青油菜。所述植物促生長劑的功能為促進植物生長。所述 促進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根系和/或葉片生長。
[0035] 本發(fā)明還保護所述HHrpEcc基因或含有所述HHrpEcc基因的表達盒或含有所述 HHrpEcc基因的重組載體或含有所述HHrpEcc基因的轉(zhuǎn)基因細胞系或含有所述HHrpEcc基 因的重組菌在促進植物生長中的應(yīng)用。所述植物可為十字花科植物，具體可為蕓苔屬植物， 更具體可為油菜，例如上海青油菜。所述促進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根系和/ 或葉片生長。
[0036] 本發(fā)明還保護一種植物促生長劑，其活性成分為所述HHrpEcc基因或含有所述 HHrpEcc基因的表達盒或含有所述HHrpEcc基因的重組載體或含有所述HHrpEcc基因的轉(zhuǎn) 基因細胞系或含有所述HHrpEcc基因的重組菌。所述植物可為十字花科植物，具體可為蕓 苔屬植物，更具體可為油菜，例如上海青油菜。所述植物促生長劑的功能為促進植物生長。 所述促進植物生長具體可體現(xiàn)為促進植物的根系和/或葉片生長。
[0037] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，具有很好的熱穩(wěn)定性、蛋白酶敏感，在I μg/ml的濃度條件 下可以明顯的誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，在低濃度（5 μ g/ml)下可以明顯促進植物根系和葉 片的生長，最終大大提高植物產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0038] 圖1為重組質(zhì)粒pBAD/HHrpEcc的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039] 圖2為實施例2中的SDS-PAGE電泳圖。
[0040] 圖3為實施例3中的SDS-PAGE電泳圖。
[0041] 圖4為實施例5中出芽后生長25天的植株照片。
【具體實施方式】
[0042] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0043] 大腸桿菌 BL21(DE3) !Invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號為 C6010-03。pBAD-hisB 載 體！Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為VT1275。如無特殊說明，實施例中的PBS緩沖液均為 pH7. 0、50mM 的 PBS 緩沖液。
[0044] 實施例1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD/HHrpEcc
[0045] 發(fā)明人設(shè)計了 HHrpEcc蛋白（分子量大小為50kDa)，然后根據(jù)HHrpEcc蛋白、以大 腸桿菌密碼子偏好性設(shè)計了 HHrpEcc基因。
[0046] HHrpEcc蛋白如序列表的序列1所示，由HrpNl區(qū)段、HrpW區(qū)段、HrpEcc區(qū)段、 HrpN2區(qū)段和HrpzPSS區(qū)段組成。序列表的序列1中，自N末端第1-29位氨基酸殘基組成 HrpNl區(qū)段，第35-83位氨基酸殘基組成HrpW區(qū)段，第87-202位氨基酸殘基組成HrpEcc區(qū) 段，第207-246位氨基酸殘基組成HrpN2區(qū)段，第251-290位氨基酸殘基組成HrpN2區(qū)段， 第302-341位氨基酸殘基組成HrpN2區(qū)段，第346-385位氨基酸殘基組成HrpN2區(qū)段，第 395-437位氨基酸殘基組成HrpzPSS區(qū)段。
[0047] HHrpEcc基因如序列表的序列2所示。
[0048] 將pBAD-hisB載體中Xho I和Pst I酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列 2所示的雙鏈DNA分子，