c 16g進行氫化反應(yīng)去除肽序中側(cè)鏈保護基N02和Bzl，從而得到戈 舍瑞林粗肽 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu)-Leu_Arg-Pr0-Azgly-NH2 甲醇溶液； 步驟九、將步驟八的氫化反應(yīng)后的甲醇溶液過濾后得到995mL加入5倍量的純水將樣 品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體 步驟十、制備得到戈舍瑞林。
[0023] 上述全保護裂解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1 :4的體積份組成，裂解條件為在 室溫下2h。
[0024] 上述步驟八中甲酸銨和Pa/c分別按粗品計算質(zhì)量的10%和5%投入。
[0025] 上述步驟八中反應(yīng)時間5h，反應(yīng)溫度40攝氏度。
[0026] 本實施例中所采用的氨基酸原料及去除條件如下表1所示： 表1
實施實例過程中所涉及的堿為：二異丙基乙胺（DIEA) 實施實例過程中所涉及的縮合試劑為：HOBT/DIC、HBTU/DIPEA 實施實例過程中所涉及的Fmoc脫除試劑為20%DBLK (哌啶：DMF=1 :4) 根據(jù)樹脂投料量Wl以及替代度sub，計算出氨基酸（W2)，DIPEA等的的投料量： W2=fflXsub XnXM2 VDIPEA ：ff I X sub X η X 3 X MDIPEA/ P DIPEA 其中n為氨基酸相當(dāng)于樹脂摩爾量的投料比，M 2為氨基酸的分子量。
[0027] 圖1顯示全保護裂解后粗肽的HPLC分析圖譜，圖譜充分顯示目的物的出峰時間， 有待生產(chǎn)人員觀察當(dāng)次合成效果也為下步全保護裂解中偶聯(lián)氨基脲峰型有無變化及偶聯(lián) 效率和偶聯(lián)結(jié)果有個很好的把控； 圖2顯示全保護裂解后粗肽偶聯(lián)氨基脲后的HPLC分析跟蹤圖譜圖譜顯示偶聯(lián)氨基脲 后分析圖譜時間前移主要目的是與圖一進行相比較使生產(chǎn)人員能夠跟蹤樣品的偶聯(lián)結(jié)果 這也是本發(fā)明為什么在液相中偶聯(lián)氨基脲的一個原因； 圖3可以充分證明20%TFA/DCM的混合溶液去除Fmoc-His(Trt)-OH側(cè)鏈的Trt效果 是很好的，可以看出去除比較徹底，峰型比較單一。
[0028] 圖4顯示的是粗品的一個純度情況，純度90%，相對較好純化制備比較容易。
[0029] 圖5,在實驗過程中粗品的MS確認為1269與戈舍瑞林成品分子量符合 圖1圖2分析條件： 儀器：DIOIVEX U3000， 色譜柱：100A 5um C18 4.6*250mm， 檢測波長：254， 流動相：A相：0. 1/%TFA B相：乙腈， 梯度：5-95， 可以根據(jù)圖譜定位分析，判斷氨基脲偶聯(lián)效果。
[0030] 附圖 3 圖3分析條件： 儀器：DIOIVEX U3000， 色譜柱：100A 5um C18 4.6*250mm， 檢測波長：254， 流動相：A相：0. 1/%TFA B相：乙腈， 梯度：5-95。
[0031] HPLC分析檢測氫化反應(yīng)效果判斷是否反應(yīng)完全 加入純水析出得到目的肽戈舍瑞林粗肽（附圖4 HPLC，附圖5 MS) Pyr-His-Trp-Ser-Tyr- D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pr〇-Azagly-NH2 MW :1269 ； 圖4分析條件： 儀器：DIOIVEX U3000， 色譜柱：100A 5um C18 4.6*250mm， 檢測波長：254， 流動相：A相：0. 1/%TFA B相：乙腈， 梯度：5-95， 圖5分析條件： 雙聯(lián)質(zhì)譜儀分離， 使用儀器：液聯(lián)質(zhì)譜(賽墨菲)， 制備條件：流動相，A相：水B相：100%乙腈， 流速：〇· 2mL/min，
[0032] 綜上，本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其醋酸戈舍瑞林的固相合成方法集 合了固、液相合成方法中各自的優(yōu)點，避免了許多副反應(yīng)現(xiàn)象，提高了目的肽的純度，收率 也相對較高，操作起來方便可行中間體可以跟蹤控制，整個過程利于放大生產(chǎn)。
[0033] 上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明 精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：包括以下步驟： 步驟一、由Fmoc-Pro-OH和替代度為1. 1-1. 3mmol/g的2-CTC Resin在激活劑N，N_ 二 異丙基乙胺的作用下，室溫反應(yīng)得到Fmoc-Pro-CTC Resin，加入20%DBLK(哌啶：DMF=1:4) 去除Fmoc得到H_ Pro-CTC Resin; 所述Fmoc-Pro-OH的結(jié)構(gòu)式如下：所述2-CTCResin的結(jié)構(gòu)式如下：步驟二、按照常規(guī)的固相合成方法，采用H0BT/DIC、反應(yīng)lh、DMF作溶劑依次偶聯(lián) 以下Fmoc保護的氨基酸Fmoc-Arg(N02) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu) -0H和 Fmoc-Tyr(Bzl)-OH得到Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(N02)-P;r〇-CTCResin; 步驟三、采用HBTU/DIPEA作為縮合體系，在DCM作溶劑的條件下，反應(yīng)lOmin，依次偶聯(lián)Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Trp-〇H得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr(Bzl) -D_Ser(tBu) -Leu-Arg(N02)-Pro -CTCResin； 步驟四、按照常規(guī)的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反應(yīng)lh、DMF作溶劑依次偶聯(lián)Fmoc-His(Trt) -OH、Pyr得到H-Pyr-His(Trt) -Trp-Ser-Tyr(Bzl) -D_Ser(tBu) -Leu-Arg(N 02)-Pro-CTCResin； 步驟五、將全保護裂解液(三氟乙醇：二氯甲烷=1 :4)按樹脂重量的10倍加入到步驟四 的肽樹脂中充分?jǐn)埌杈磳-Pyr-His(Trt) -Trp-Ser-Tyr(Bzl) _D_Ser(tBu) -Leu-Arg(N0 2)-Pr〇-2-CTCResin中的載體2-CTCResin去除，但保留所有側(cè)鏈保護基； 步驟六、將全保護裂解液用DIPEA(N，N-二異丙基乙胺）調(diào)成偏堿性PH=7. 8-8. 5優(yōu)選 7. 8-8. 2按摩爾量的3倍將稱量好的鹽酸氨基脲和PyBop(1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯 烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián)劑)加入PH在7. 8-8. 2左右的全保護裂解液中進行反應(yīng)偶 聯(lián)，從而得到保留側(cè)鏈保護基的戈舍瑞林前體肽IPyr-His(Trt) -Trp-Ser-Tyr(Bzl) -D-S er(tBu) -Leu-Arg(N02)-Pr〇-Azgly-NH2的溶液狀態(tài)將其溶液旋蒸濃縮成粘稠狀物或是固 體狀物； 步驟七、配置20%TFA/DCM的裂解液緩慢加入到步驟六中的粘稠狀物中使其攪拌室溫 裂解2h，再將其裂解液緩慢加入冰凍的乙醚中放置30min進行沉降即得到去除His(Trt) 上的側(cè)鏈保護基Trt得到前體肽IIPyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg (N02) -Pr〇-Azgly-NH2 的白色固體物； 步驟八、將步驟七中的前體肽II白色固體物真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸銨和Pa/c進行氫化反應(yīng)去除肽序中側(cè)鏈保護基^32和Bzl，從而得到戈舍瑞林粗肽Pyr-His-Trp-Ser -Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-P;r〇-Azgly-NH2 的甲醇溶液； 步驟九、將含有甲醇溶液的戈舍瑞林粗品進行過濾去除過量的Pa/c及甲酸銨然后加 入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體， 制備得到戈舍瑞林。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述全保護裂 解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1 :4的體積組成，裂解條件為在室溫下2h。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述步驟八中 甲酸銨和Pa/c分別按粗肽計算質(zhì)量的10%和5%投入。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述步驟九還 包括：將步驟八的氫化反應(yīng)后的甲醇溶液過濾加入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度 90%的戈舍瑞林粗肽固體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述步驟八中 反應(yīng)時間5h，反應(yīng)溫度為40攝氏度。
【專利摘要】本發(fā)明一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，包括：采用HBTU/DIPEA作為縮合體系，依次偶聯(lián)Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Trp-OH；將全保護裂解液按樹脂重量的10倍加入相應(yīng)體積的量將中間產(chǎn)物中的載體2-CTC Resin去除，但保留所有側(cè)鏈保護基；將全保護裂解液用DIPEA（N，N-二異丙基乙胺）調(diào)成偏堿性并將鹽酸氨基脲和PyBop（1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián)劑）加入全保護裂解液中進行反應(yīng)偶聯(lián)，得到保留側(cè)鏈保護基的戈舍瑞林肽溶液； 將20%TFA/DCM 的裂解液加入冰凍的乙醚中沉降獲得白色固體粗肽；將白色固體粗肽真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸銨和Pa/c進行氫化反應(yīng)去除肽序中側(cè)鏈保護基。本發(fā)明避免了許多副反應(yīng)現(xiàn)象，提高了目的肽的純度，收率也相對較高，操作起來方便可行中間體可以跟蹤控制，整個過程利于放大生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K1/06, C07K1/04, C07K7/23, C07K1/02
【公開號】CN104910257
【申請?zhí)枴緾N201510005951
【發(fā)明人】夏丹, 王良友, 孫鋒
【申請人】蘇州天馬醫(yī)藥集團天吉生物制藥有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年1月7日