步驟三中偶聯(lián)Fmoc-Trp-OH， Fmoc-Ser-OH采用的縮合試劑組HBTU/DIPEA，DCM作溶劑反應(yīng)時間為IOmin與常規(guī)偶聯(lián)方 法采用縮合試劑組HOBT/DIC DMF作溶劑反應(yīng)時間為Ih相比大大的縮短了反應(yīng)時間控制了 Fmoc-Trp-〇H、Fmoc-Ser-OH兩個氨基酸側(cè)鏈未保護(hù)反應(yīng)中產(chǎn)生副反應(yīng)及雜質(zhì)的問題。
[0018] 3.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其肽序中的Fmoc-His(Trt)-OH的側(cè)鏈 保護(hù)基采用的是Trt保護(hù)，主要是利用Trt與tBu對酸的敏感度的不同來達(dá)到去除Trt保留 tBu的這樣一個目的，權(quán)利要求書步驟七中主要是利用20%TFA/DCM (TFA :DCM=1 :4)混合溶 液一次去除 Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg(N02)-Pr〇-Azgly-NH2 肽序中的側(cè)鏈保護(hù)基Trt。與現(xiàn)有專利0. 1%-3%反復(fù)裂解五次，省去了大量成本及人力 又能很好的控制保護(hù)基tBu不受影響以便確保反應(yīng)質(zhì)量。本發(fā)明簡單易行首先利用原 料Fmoc-His (Trt) -OH參與反應(yīng)，因?yàn)閭?cè)鏈被保護(hù)所以側(cè)鏈不參與合成中的反應(yīng)，不會帶 來相應(yīng)的副反應(yīng)及相應(yīng)的雜質(zhì)，待合成完全結(jié)束后再將其側(cè)鏈保護(hù)基去除，解決了現(xiàn)有 專利技術(shù)中采用Fmoc-His-OH在合成反應(yīng)過程由于側(cè)鏈沒有保護(hù)又沒有現(xiàn)有條件能控 制其側(cè)鏈不參與反應(yīng)由此在反應(yīng)中副反應(yīng)大反應(yīng)雜質(zhì)多的這樣一個缺點(diǎn)，同時也解決了 Fmoc-Hi s-〇H 采用別的保護(hù)基如：（Fmoc-His(Fmoc)-OH Fmoc-Hi s(mmt)-OH 等)操作復(fù)雜， 合成難度大，在實(shí)驗(yàn)過程中我們也嘗試過選擇Fmoc-His (Fmoc)-OH作為原料但在同樣的 合成條件下Fmoc-His(Trt)-OH只要反應(yīng)30min就可完成而Fmoc-His(Fmoc)-OH則需反應(yīng) 20_40h還反應(yīng)不完全Fmoc-His (mmt) -OH也存在同樣的難題。
[0019] 4.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其采用的精氨酸和酪氨酸的側(cè)鏈保護(hù) 基為N02和Bzl，可利用氫化反應(yīng)一步去除成功，將帶有N02和Bzl的Pyr-His-Trp-Ser-T yr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-Arg (N02) -Pr〇-Azgly-NH2的白色固體粗肽用甲醇溶解后加入 甲酸銨和Pa/c (按按粗肽計算質(zhì)量的10%和5%分別投入)進(jìn)行氫化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40攝 氏度反應(yīng)時間5h過濾得到戈舍瑞林粗肽甲醇溶液將溶液進(jìn)行過濾去除過量的Pa/c及甲酸 銨然后加入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體，制備得到戈 舍瑞林。
[0020] 5.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，將Fmoc-His(Trt)-OH偵Ij鏈上的Trt用 酸去除，然后再利用氫化反應(yīng)將Fmoc-Arg (N02) -OH和Fmoc-Tyr (Bzl) -OH上的N02和Bzl 去除，過濾掉鈀碳后用5倍純水析出離心得到固體戈舍瑞林粗肽，用少量的乙腈溶成糊狀 后加水至溶解澄清，給純化制備帶來方便，，以至于純化制備一次可得到戈舍瑞林目的物 99%，解決了現(xiàn)有技術(shù)中純化的制備溶液為二氯甲烷反復(fù)上樣反復(fù)沖出導(dǎo)致收率降低的成 本較高的一個不足點(diǎn)，同時也很好的解決了現(xiàn)有技術(shù)中到純化制備的溶液中含有大量的 酸，在制備過程中需用大量的堿與其中和，才可制備純化，整個的酸堿中和過程中會大量的 放熱，危險性較大，不可以實(shí)行放大生產(chǎn)的一個大問題。
【附圖說明】
[0021] 附圖1為本發(fā)明全保護(hù)裂解后粗肽的HPLC分析圖譜； 附圖2為本發(fā)明全保護(hù)裂解后粗肽偶聯(lián)氨基脲后的HPLC分析跟蹤圖譜； 附圖3為本發(fā)明顯示的是粗品的一個純度情況圖； 附圖4為本發(fā)明儀器DIOIVEX U3000分析的戈舍瑞林粗品HPLC圖譜圖； 附圖5為本發(fā)明雙聯(lián)質(zhì)譜儀分析檢測戈舍瑞林粗品MS圖譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述： 實(shí)施例：一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，包括以下步驟： 步驟一、根據(jù)預(yù)設(shè)替代度sub (0. 6mmol/g) =n (合成規(guī)模）/ (X(iS Mrc Ke;sin+nH<M)氨基 酸分子量這里指Fmoc-Pro-OH的分子量）可計算出X(裸2-CTC Resinz的質(zhì)量）=266g Fmoc-Pro-OH在合成樹脂的步驟中投料量為摩爾量的1. 3倍即計算得出Fmoc-Pro-OH為 87g將稱取替代度為I. 1~1. 3mmol/g的2-CTC Resin266g (合成規(guī)模200mmol)加入反應(yīng) 柱中同時加入3000mlDMF溶脹20min，溶脹后抽掉DMF，在加入3000mlDMF洗滌兩次，每 次Imin.將稱量好的Fmoc-Pr〇-OH87g在DMF/DCM的混合溶液中冰浴條件下加入摩爾量 兩倍的DIPEA(N，N-二異丙基乙胺）的作用下，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時間由所期待的替代度決 定。反應(yīng)后處理DMF洗滌5次每次3000ml每次lmin，然后加入3000ml封閉液（DCM :甲醇： DIPEA=80 :15 :5)封閉兩次每次 IOmin 得到 sub=0. 6mmol/g 的 Fmoc-Pro-CTC Resin，加入 3000ml20%DBLK (哌啶：DMF=1 :4)去除Fmoc兩次，每次時間為IOmin待去除完畢后加入 3000m 的 DMF 洗滌兩次，得到 H-Pro-CTC Resin ;這里所述 Fmoc-Pro-OH 和 2-CTC Resin 的 結(jié)構(gòu)式同權(quán)利要求說明書步驟一 步驟二、按照常規(guī)的固相合成方法，將步驟一中的脫完Fmoc的H- Pro-CTC Resin用 DMF洗滌4次，每次3000ml，洗滌時間lmin，將稱量好Fmoc-Arg (N02) -OH9 (摩爾量的3倍）、 和HOBT (摩爾量的3倍）投入反應(yīng)柱中補(bǔ)加 DIC、反應(yīng)lh、待反應(yīng)完畢后取樹脂20-30粒用 少量DMF洗滌兩遍進(jìn)行茚三酮檢測顯陽性則表明反應(yīng)未完全需繼續(xù)反應(yīng)或是重復(fù)偶聯(lián)，若 檢測顯陰性則表明反應(yīng)完全可進(jìn)行下一步的偶聯(lián)反應(yīng)，按以上步驟依次偶聯(lián)以下Fmoc保 護(hù)的氨基酸 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser (tBu)-OH 和 Fmoc-Tyr(Bzl) -OH 得到 Fmoc-Tyr (B zI)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin ； 步驟三、將 Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin 加入 3000mlDBLK去除Fmoc后DMF洗滌4次，每次3000ml，時間lmin，加入稱量好HBTU (摩爾 量的3倍)和Fmoc-Ser-OH (摩爾量的3倍）投入反應(yīng)柱中補(bǔ)加 DIPEA和DCM使其攪拌均勻 反應(yīng)10min抽掉反應(yīng)液加入DMF洗滌3次，每次3000ml，洗滌時間Imin取樹脂20-30粒茚 三酮檢測顯陽性則表明反應(yīng)未完全需繼續(xù)反應(yīng)或是重復(fù)偶聯(lián)，若檢測顯陰性則表明反應(yīng)完 全可進(jìn)行下一步的偶聯(lián)反應(yīng)按以上步驟偶聯(lián)Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr (Bzl)-D -Ser (tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin ； 步驟四、按照常規(guī)的固相合成方法同步驟二，采用H0BT/DIC、反應(yīng)lh、DMF作溶劑依次 偶聯(lián) Fmoc-His (Trt) -〇H、Pyr 得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-A rg(N02)-Pro-CTC Resin 肽樹脂 520g ; 步驟五、按1:10 (w:v)的樹脂與裂解液的比例配制全保護(hù)裂解液5200mL (V三:V二 氯甲煉=1:4)加入到 H-Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pro_2-CTC Resin肽樹脂中的攪拌反應(yīng)2h，待反應(yīng)完畢后過濾抽掉樹脂保留溶液目的去除其載體 2-CTC Resin ； 步驟六、將全保護(hù)裂解液取出Iml作HPLC分析定位出峰時間1，然后再將其溶液用 DIPEA (N，N-二異丙基乙胺)調(diào)成偏堿性PH=7. 8-8. 5優(yōu)選7. 8-8. 2按摩爾量的3倍將稱量 好的鹽酸氨基脲和PyBop (IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián) 劑)加入PH在7. 8-8. 2左右的全保護(hù)裂解液中進(jìn)行反應(yīng)偶聯(lián)，反應(yīng)時間Ih，待反應(yīng)完畢后 取出Iml同樣條件下作HPLC分析定位出峰時間2,然后根據(jù)峰型的變化及有無前移情況從 而判斷跟蹤氨基脲的偶聯(lián)情況，如峰型有變化但反應(yīng)前的峰1沒有完全轉(zhuǎn)變到反應(yīng)Ih后的 峰2說明還未反應(yīng)完全需繼續(xù)反應(yīng)，若反應(yīng)前的峰1完全轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)Ih后的峰2說明已經(jīng) 反應(yīng)完全則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)最后得到保留側(cè)鏈保護(hù)基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His(T rt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02)-Pr0-Azgly_NH2 再將其溶液旋蒸濃縮 Ih后變?yōu)榈S色粘稠狀物； 步驟七、配置20%TFA/DCM的裂解液（V:V=1:4)緩慢加入到步驟六中的粘稠狀物中使 其攪拌室溫裂解2h，再將其裂解液緩慢加入冰凍的乙醚中放置30min進(jìn)行沉降即得到去除 His (Trt)上的側(cè)鏈保護(hù)基 Trt 前體肽 II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-A rg (N02)-Pr0-Azgly-NH2 320g 步驟八、將步驟七的白色固體粗肽真空抽干按lg/4ml用甲醇溶解溶解體積為1110ml， 加入甲酸銨32g和Pa/