一株芽孢桿菌及其在高鹽廢水中降解有機(jī)物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株芽孢桿菌及其在高鹽廢水，特別是高鹽生活污水中降解有機(jī)物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]高鹽廢水是指含有有機(jī)污染物和至少3.5% (質(zhì)量濃度)的總?cè)芙夤腆w物(TDS)的廢水，屬于難生物處理廢水。高鹽廢水的總含鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)多1%，其中所含鹽類(lèi)物質(zhì)多為Cl、SO42、Na+、Ca2+。
[0003]我國(guó)高鹽廢水產(chǎn)生數(shù)量在總廢水中達(dá)5%，每年仍以2%的速率增長(zhǎng)。高鹽廢水主要來(lái)源于海水代用排放的廢水，如發(fā)達(dá)國(guó)家年海水冷卻水用量已經(jīng)超過(guò)了 1000億立方米，目前我國(guó)海水的年利用量為60多億立方米。此外，還有工業(yè)廢水和其他高鹽廢水，例如我國(guó)西北邊疆地區(qū)由于地理環(huán)境問(wèn)題所排放的生活污水等。高鹽廢水中離子濃度過(guò)高，則會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制和毒害作用，鹽濃度高、滲透壓高、微生物細(xì)胞脫水引起細(xì)胞原生質(zhì)分離；鹽析作用使脫氫酶活性降低ΚΓ1濃度高對(duì)細(xì)菌有毒害作用；由于水的密度增加，活性污泥易上浮流失，嚴(yán)重影響生物處理系統(tǒng)的凈化效果。
[0004]因此仍需要研發(fā)適于高鹽廢水處理的微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為此，本發(fā)明的目的是提供一株芽孢桿菌及其在高鹽廢水中降解有機(jī)物的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的第一方面提供一株芽孢桿菌(Bacillus sp.) Y5，該菌株已于2015年02月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.10527。本發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus sp.) Y5簡(jiǎn)稱(chēng)芽抱桿菌Y5。
[0007]本發(fā)明的第二方面提供一種用于高鹽廢水處理的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括本發(fā)明的芽孢桿菌Y5培養(yǎng)液的凍干粉末。
[0008]所述凍干粉末優(yōu)選是用濃度為18?10 9cfu/mL的所述芽孢桿菌Y5的高鹽無(wú)機(jī)培養(yǎng)液凍干而成。
[0009]所述高鹽無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中的鹽濃度為30?80g/L，優(yōu)選為40?60g/L，具體可為50g/L NaCl。所用高鹽無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH值為6.0?8.0，優(yōu)選7.0?7.5，具體可為7.25。
[0010]所述高鹽無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中除用于產(chǎn)生鹽度的NaCl外，主要是適于細(xì)菌篩選的常規(guī)無(wú)機(jī)培養(yǎng)液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇適宜的無(wú)機(jī)培養(yǎng)液。本發(fā)明采用的是基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液，其中典型地包括:NaCl 0.5g、MgSO4 0.5g、NH4Cl 0.5g、KH2PO4 0.5g、K2HPO41.5g、NH4NO3 1.0g、酵母膏0.05g?將各組分依次溶解后調(diào)節(jié)pH = 7.0,最后定容至IL0[0011 ] 優(yōu)選將所述芽孢桿菌Y5接種至所述高鹽無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在25?40°C (如37°C )振蕩培養(yǎng)12?36小時(shí)(如24小時(shí))，然后將培養(yǎng)液凍干。
[0012]更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種制備上述產(chǎn)品的方法，包括如下步驟:將所述芽孢桿菌Y5接種至所述高鹽無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，(例如可以在25?40°C (如37°C)振蕩培養(yǎng)12?36小時(shí)(如24小時(shí)))，然后將培養(yǎng)體系凍干，得到所述產(chǎn)品。
[0013]優(yōu)選地，接種后，所述芽孢桿菌Y5的初始濃度具體可為13?105cfu/mL，如104cfu/mL。完成所述振蕩培養(yǎng)后，所述培養(yǎng)體系中所述芽孢桿菌Y5的濃度可達(dá)到為18?109cfu/mL。所述振動(dòng)培養(yǎng)可采用任何合適的轉(zhuǎn)速，例如200r/min。
[0014]本發(fā)明的第三方面提供所述芽孢桿菌及上述含有本發(fā)明芽孢桿菌的產(chǎn)品在高鹽廢水處理中的應(yīng)用。具體地用于降解高鹽廢水、特別是高鹽生活污水中有機(jī)物的應(yīng)用。應(yīng)用所述芽孢桿菌或所述產(chǎn)品處理高鹽廢水時(shí)，反應(yīng)體系的PH值可為6.0?8.0，優(yōu)選為7.0?8.0。
[0015]所述高鹽廢水中的鹽濃度可為5g/L以上，可以達(dá)到10?30g/L。所述鹽度為NaCl鹽度(即，將廢水中的鹽度換算為NaCl來(lái)表示)。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種高鹽廢水處理方法，包括以下步驟:在高鹽廢水中投入所述芽孢桿菌Y5或所述產(chǎn)品，并發(fā)酵一段時(shí)間。其中所述高鹽廢水的含鹽量由NaCl提供為5g/L以上，優(yōu)選為10?30g/L，pH值為6.0?8.0，優(yōu)選為7.0?8.0。
[0017]根據(jù)一種實(shí)施方式，所述發(fā)酵的溫度為10°C?40°C，優(yōu)選為20°C?35°C。發(fā)酵時(shí)間為80?100小時(shí)。
[0018]根據(jù)一種實(shí)施方式，所述芽孢桿菌或所述產(chǎn)品的投入量為使高鹽廢水中初始菌含量為 14?10 5cfu/mL。
[0019]本發(fā)明從某污水處理廠的活性污泥中分離到一株能夠高效降解高鹽廢水中有機(jī)物的菌株。經(jīng)形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察，鑒定出該菌為芽孢桿菌。該菌株對(duì)高鹽廢水中有機(jī)物具有很高降解效果。該菌在高鹽廢水的高鹽濃度溶液和低溫的條件下，依然表現(xiàn)出良好的降解能力。實(shí)際應(yīng)用中，可將該菌株擴(kuò)大培養(yǎng)制成成品菌懸液或粉劑，投放于實(shí)際的廢水體系中。本發(fā)明具有成本低、操作簡(jiǎn)單、降解效率高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:(1)本發(fā)明的菌株可適應(yīng)廢水中高鹽高有機(jī)物的特性，可適用范圍寬；(2)采用該菌株進(jìn)行高鹽污水處理具有成本低、操作簡(jiǎn)單、降解效率高的優(yōu)點(diǎn)；(3)采用該菌株進(jìn)行污水處理環(huán)境相容性好，可減少或避免使用化學(xué)試劑，避免二次污染。本發(fā)明的菌株在高鹽類(lèi)物質(zhì)污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為本發(fā)明芽孢桿菌Y5的16S rRNA的序列。
[0022]圖2為實(shí)施例2中各個(gè)樣本中有機(jī)物的濃度。
[0023]圖3為實(shí)施例3中各個(gè)樣本中有機(jī)物的濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0025]LB培養(yǎng)基的制備方法:將1g胰化蛋白胨、5g酵母提取物和所需鹽度相應(yīng)的NaCl用MiLL1-Q水溶解并定容至1L。
[0026]無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的制備方法:將4g K2HPO4,4g NaH2PO4、0.5g MgSO4.7Η20、0.0lgCaCl2.H2O,0.0lg FeS047.H2O,0.0lg MnSO4.2Η20 按順序溶于 MiLL1-Q 水，定容至 1L，并調(diào)節(jié)pH至7.0?7.2。在該無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的鹽度加入氯化鈉后使用。
[0027]實(shí)施例中所用的緩沖液是1M、pH為7.0的PBS緩沖液。
[0028]實(shí)施例1、芽孢桿菌Y5的獲得和鑒定
[0029]一、芽孢桿菌Y5的獲得
[0030]污泥樣本為2014年3月取自北京市某污水處理廠活性污泥。
[0031]在容器中，加入少量污泥樣品以及鹽度為20g/L的LB液體培養(yǎng)液，于搖床中25°C恒溫振蕩48小時(shí)后取5mL培養(yǎng)液，加入新鮮的20g/L的LB液體培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，再取5mL培養(yǎng)液加入新鮮的20g/L的LB液體培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)操作一周。最后取5mL培養(yǎng)液投加到鹽度為30g/L的新鮮LB液體培養(yǎng)液中在同樣條件下培養(yǎng)48小時(shí)，按上述方法在鹽度為30g/L的培養(yǎng)液中反復(fù)操作培養(yǎng)一周，在將培養(yǎng)液的鹽度提高到40g/L，以此類(lèi)推，最后將LB液體培養(yǎng)液的鹽度升高到80g/L，并在該鹽度下反復(fù)培養(yǎng)操作一周，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐高鹽的機(jī)制，從中獲得耐鹽菌株。然后采用液體稀釋法獲得純培養(yǎng)的菌株，再通過(guò)高鹽廢水中有機(jī)物降解實(shí)驗(yàn)，從中篩選對(duì)有機(jī)污染物去除能力強(qiáng)的菌株。
[0032]最終獲得一株耐高鹽的菌株，將其命名為Y5。
[0033]二、芽孢桿菌Y5的鑒定
[0034]1、形態(tài)鑒定
[0035]菌落形態(tài):菌落直徑2_左右菌落，全緣，無(wú)色，半透明。革蘭氏陽(yáng)性菌，生芽孢，需氧、化能異養(yǎng)。
[0036]2、生理生化鑒定
[0037]可利用D-核糖、糖元、葡萄糖等多種碳源。
[0038]3、分子鑒定
[0039]對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA鑒定，其編碼序列如圖1所示。將16S rRNA的編碼序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與其同源性最好的菌株為Bacillus subtilis (GENBANK ACCESS1NN0.EU-144043.1)，同源性為 99%。
[0040]三、芽孢桿菌Y5的保藏
[0041]根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生理生化、16S rRNA鑒定的結(jié)果，菌株屬于芽孢桿菌(Bacillussp.)。雖然保藏中心最后將該菌株鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，但是通過(guò)對(duì)照發(fā)育樹(shù)，可以認(rèn)定該菌株屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，同源性超過(guò)99%。
[0042]芽孢桿菌(Bacillus sp.) Y5，已于2015年02