七鰓鰻口腔腺寄生菌株lj1、分泌蛋白、分離方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌蛋白活性高，即能夠同時(shí)降解纖維蛋白原Aa鏈、Ββ鏈和γ鏈，又能夠降解纖維蛋白的七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJ1、分泌蛋白、分離方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類平均壽命的延長、生活環(huán)境以及膳食習(xí)慣的變化，心、腦血管疾病的發(fā)病率、死亡率和致殘率正逐年增高。最常見的是血栓性心腦血管疾病，通常表現(xiàn)為心肌梗死、腦卒中以及周圍血管病變。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年平均有1700萬人被心腦血管血栓疾病奪走生命，占世界總死亡人數(shù)的30%。市場上對(duì)預(yù)防和治療血栓性疾病藥物的需求量已呈現(xiàn)出逐年增長之勢(shì)。纖維蛋白原和纖維蛋白是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中兩個(gè)關(guān)鍵的底物蛋白質(zhì)。目前，研宄人員已從蛇的毒腺、吸血?jiǎng)游锏耐僖合?、植物以及?xì)菌中分離得到了多種具有纖溶活性的水解酶一纖溶酶，用于制備抗凝溶栓藥物。但是現(xiàn)有纖溶酶活性較低，只能降解纖維蛋白原，多數(shù)對(duì)纖維蛋白并無作用。且大多只能降解纖維蛋白原的Aa鏈和Ββ鏈，基本不降解纖維蛋白原的γ鏈。只有來源于真菌(/7Zetfroiw1S osireaiiAs)、植物{Car i ca caflt/afflarceflsis)、蜜蜂毒腺(Cb/ws和粉正蟲引rube I Ius)的蛋白酶才能夠全部降解纖維蛋白原Aa鏈、Ββ鏈和γ鏈。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種分泌蛋白活性高，即能夠同時(shí)降解纖維蛋白原Aa鏈、Ββ鏈和γ鏈，又能夠降解纖維蛋白的七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl、分泌蛋白、分離方法及用途。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種七鮑饅口腔腺寄生菌株LJl (Stenotrophomonasmaltophilia )，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.10680。
[0005]一種上述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]一種上述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分離方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行:
a.取七鰓鰻口腔腺分泌液；
b.用pH7.4、含有50 mM NaCl的50 mM Tris-HCl將分泌液稀釋100倍，
然后涂LB平板于37°C恒溫培養(yǎng)過夜；
c.從LB平板上挑取單克隆菌落于含有5ml LB的培養(yǎng)基中，28°C搖床中培養(yǎng)12~48
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[0007]一種上述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白在制備抗血栓類藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明從七鰓鰻口腔腺分泌液中分離得到具有高纖溶活性的菌株，屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，菌株代碼LJ1，拉丁文學(xué)名maltophilia，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.10680，菌種保藏日期:2015年4月2日。該菌株所分泌天然蛋白是一種高活性纖溶酶，能夠在幾秒鐘內(nèi)迅速降解血液中的纖維蛋白原的三條多肽鏈，從而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且還能夠通過直接降解纖維蛋白或激活纖溶酶原從而具有溶栓作用；對(duì)血液中的其他組分均無明顯的降解作用，表明該分泌蛋白具有較強(qiáng)的專一性，在抗血栓類藥物領(lǐng)域有較高的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白的纖維蛋白原水解酶活性效果示意圖。
[0010]圖2是本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白的纖維蛋白水解酶活性檢測效果圖。
[0011]菌種保藏日期:2015-04-02。
[0012]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。
[0013]菌種保藏代號(hào):CGMCC 10680。
保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
【具體實(shí)施方式】
[0014]七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分離:
a.在中國黑龍江省松花江同江流域捕獲處于洄游期的成體日本七鰓鰻數(shù)條，在無菌條件下剝離位于眼眶下、口腔內(nèi)、呈豆子形狀的口腔腺體，將腺體內(nèi)的液體(分泌液)抽出；
b.無菌條件下，將分泌液用無菌的、含有50mM NaCl的50 mM Tris-HCl (pH 7.4)稀釋100倍，然后涂LB平板于37°C恒溫培養(yǎng)過夜；
c.從LB平板上挑取單克隆菌落于含有5ml LB的培養(yǎng)基中，于28°C搖床中培養(yǎng)12~48h，獲得菌株。
[0015]對(duì)所獲得菌株進(jìn)行了 16S rDNA鑒定、生理生化性質(zhì)分析及菌株的保存。
[0016]該菌株的16S rDNA如SEQ ID NO:1所示，屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，菌株代碼LJ1， 文學(xué)名Stenotrophomonas maltophilia，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.10680，菌種保藏日期:2015年4月2日。
[0017]七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl分泌蛋白的制備:
采用硫酸銨沉淀富集活性菌株上清，經(jīng)透析及冷凍干燥后，運(yùn)用離子交換層析(DEAE-Sephadex) /疏水層析(Phenyl Sepharose ? CL-4B)分離純化得到電泳純蛋白；經(jīng)質(zhì)譜鑒定、N末端測序及基因克隆方法獲得該蛋白的cDNA序列。BCA法測定分泌蛋白質(zhì)的濃度；12%十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜檢測目的蛋白質(zhì)的純度。
[0018]七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl分泌蛋白的開放閱讀框序列為1854 bp長，蛋白質(zhì)有617個(gè)氨基酸組成，其cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0019]實(shí)驗(yàn):
1.本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白的纖維蛋白原水解酶活性實(shí)驗(yàn):
將人纖維蛋白原(2.5mg/ml)與本發(fā)明實(shí)施例的分泌蛋白(10 μ g)于37°C反應(yīng)，并于10秒、30秒、I分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘和30分鐘時(shí)取樣，采用12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖1所示:1，纖維蛋白原對(duì)照；2-9依次為本發(fā)明實(shí)施例的分泌蛋白與纖維蛋白原反應(yīng)時(shí)間為10秒、30秒、I分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘和30分鐘結(jié)果。結(jié)果表明當(dāng)本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白與纖維蛋白原反應(yīng)10秒時(shí)，大部分纖維蛋白原的Aa鏈已發(fā)生降解；小部分的Ββ鏈發(fā)生降解；反應(yīng)時(shí)間為30秒時(shí)，Aa鏈已完全被降解；反應(yīng)時(shí)間為2分鐘時(shí)，B β鏈被完全降解；反應(yīng)時(shí)間為10分鐘時(shí)，γ鏈開始發(fā)生降解；反應(yīng)時(shí)間為15分鐘時(shí)，該分泌蛋白對(duì)纖維蛋白原γ鏈的降解反應(yīng)已達(dá)到平衡，在35 kDa-45 kDa之間產(chǎn)生很明顯的降解帶。
[0020]2.纖維蛋白平板法檢測本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白的纖維蛋白水解酶活性及纖溶酶原激活劑活性。
[0021]纖維蛋白平板法是目前最為經(jīng)典的測定纖溶酶活力的方法，其原理是利用凝血酶引起纖維蛋白原形成纖維蛋白制成平板以檢測纖維蛋白水解酶活性。以標(biāo)準(zhǔn)蚓激酶和標(biāo)準(zhǔn)尿激酶作為對(duì)照，測定本發(fā)明分泌蛋白的纖維蛋白水解酶活性。
[0022]緩沖液A20 mM Tris-HCl，pH 8.0
緩沖液 B20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.0
瓊脂糖溶液75 mg/mL溶于緩沖液B
纖維蛋白原溶液50 mg/mL溶于緩沖液A
凝血酶200 U/mL溶于緩沖液A
纖溶酶原溶液60 U/mL溶于緩沖液A
a.瓊脂糖溶液100mL在微波爐中加熱溶解，在60°C的水浴中至少保溫25分鐘；
b.迅速加入15.0 mL的纖維蛋白原溶液，0.5 mL凝血酶溶液和1.0 mL的纖溶酶原溶液，輕輕晃動(dòng)混勻；
c.將混合液迅速倒入8塊滅菌的塑料平皿中(=5.0 cm)，待其冷卻凝固后，于4°C下保存?zhèn)溆?，此平板為富含纖溶酶原的平板，記為陽性板(+);
d.制作不含纖溶酶原的陰性(一)平板時(shí)，不加纖溶酶原溶液；為避免市售的纖維蛋白原中可能含有的纖溶酶原，將制好的平板須放在80°C下滅活30分鐘；
e.測活時(shí)，在平板上打孔，加入待測樣品，37°C下溫箱保溫16小時(shí)后取出觀察是否有溶圈出現(xiàn)。
[0023]結(jié)果如圖2所示:圖2中A:不含有纖溶酶原的纖維蛋白平板(陰性)。B:含有纖溶酶原的纖維蛋白平板(陽性)。1，尿激酶(25 U);2，蚓激酶(2 U) ;3，本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白(10 μ g)o
[0024]顯示:在不含有纖溶酶原的纖維蛋白平板上(陰性纖維蛋白平板)，本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白能夠像蚓激酶(陽性對(duì)照)一樣在陰性纖維蛋白平板上形成明顯的纖維蛋白溶圈，表明該組分能夠直接水解纖維蛋白；此時(shí)，尿激酶由于需要通過依賴激活纖溶酶原從而在纖維蛋白平板上形成溶圈，因此不能在陰性纖維蛋白平板上形成溶圈。在含有纖溶酶原的纖維蛋白平板上(陽性纖維蛋白平板)，本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白依然能夠在陽性纖維蛋白平板上形成纖維蛋白溶圈，表明其具有纖維蛋白水解酶活性。此外，陽性纖維蛋白平板上的溶圈面積比陰性纖維蛋白平板上的溶圈面積大，提示本發(fā)明實(shí)施例分泌蛋白還具有激活纖溶酶原的活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種七鮑饅口腔腺寄生菌株LJl ( Stenotrophomonas maltophiIia )，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.10680。2.一種如權(quán)利要求1所述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白，其特征在于其cDNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一種如權(quán)利要求1所述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分離方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行: a.取七鰓鰻口腔腺分泌液； b.用pH7.4、含有50 mM NaCl的50 mM Tris-HCl將分泌液稀釋100倍，然后涂LB平板于37 °C恒溫培養(yǎng)過夜；c.從LB平板上挑取單克隆菌落于含有5ml LB的培養(yǎng)基中，28°C搖床中培養(yǎng)12~48h04.一種如權(quán)利要求2所述七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJl的分泌蛋白在制備抗血栓類藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種七鰓鰻口腔腺寄生菌株LJ1（Stenotrophomonas maltophilia ），已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 10680。該菌株所分泌天然蛋白是一種高活性纖溶酶，能夠在幾秒鐘內(nèi)迅速降解血液中的纖維蛋白原的三條多肽鏈，從而有效抑制血液凝固及血栓形成；并且還能夠通過直接降解纖維蛋白或激活纖溶酶原從而具有溶栓作用；對(duì)血液中的其他組分均無明顯的降解作用，表明該分泌蛋白具有較強(qiáng)的專一性，在抗血栓類藥物領(lǐng)域有較高的應(yīng)用前景。CGMCC No. 1068020150402
【IPC分類】A61P7/02, C12N1/02, A61K38/16, C07K14/195, C12N1/20
【公開號(hào)】CN104894013
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510255294
【發(fā)明人】李慶偉, 肖蓉, 唐敏, 李麗
【申請(qǐng)人】遼寧師范大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月19日