子鏈及孢子形態(tài)圖。菌株在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上生長較快，在酵母膏-麥芽膏瓊脂(ISP2)、燕麥瓊脂(ISP3)和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長速度次之；在ISP2、ISP3、ISP4、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基(ISP5)、察氏瓊脂、高氏一號、PDA和NA培養(yǎng)特征培養(yǎng)基上均產(chǎn)生白色氣絲，但不產(chǎn)可溶性色素。參照《伯杰氏細(xì)菌分類定手働){Second Edit1n, Volume 5 The Actinobacteria)和東秀株編著的《常見細(xì)菌分類鑒定手冊》中的方法進(jìn)行溫度和PH值、發(fā)酵類型、代謝底物、營養(yǎng)依賴型等方面對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定，進(jìn)一步依據(jù)16S rRNA基系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，將菌株EGI 80425歸為擬諾卡式菌屬而且該菌株是一個擬諾卡氏菌iNocard1psis sp.)。
[0018]本發(fā)明利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物PCR擴(kuò)增菌株EGI 80425的16S rRNA基因，其產(chǎn)物連接到T-Vector上進(jìn)行測序，并對其進(jìn)行序列分析。EGI 80425的16S rRNA基因序列見SEQ ID N0.1。通過GenBank網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的BLAST進(jìn)行16S rRNA基因序列相似性搜索，結(jié)果顯不，菌株EGI 狄與 Nocard1psis dassonvillei subsp.0kssoflFiJJei的 16SrRNA基因相似性最高(96.4%)。從GenBank、EMBL和DDBJ等數(shù)據(jù)庫中選取與EGI 80425 16SrRNA基因序列相似性較高的序列，用軟件Clustal X和軟件Mega 6.0CNeighbour-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，EGI 80425與擬諾卡式菌屬生效發(fā)表物種聚在一起，且單獨(dú)成為一個分支，這些結(jié)果表明該菌株是擬諾卡式菌屬一個潛在的新種。
[0019]本發(fā)明進(jìn)而提供擬諾卡氏菌sp.) EGI 80425的分離和培養(yǎng)方法。
[0020](I)本發(fā)明土樣采自準(zhǔn)噶爾盆地天然高鹽堿地，土樣采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室保藏于4°C。稱2g 土樣于18 mL無菌水中進(jìn)行梯度稀釋，取200 yL10 — 6、10 — 7稀釋液涂布于ISP2平板上(培養(yǎng)基成分(g/L):yeast extract 4.0，maltextract 4.0，glucose 10.0，NaCl 30 ； trace salts I mL，純水 1000 mL ;滅菌結(jié)束后用10 N NaOH將pH調(diào)至10.0)，于37 V培養(yǎng)3周后，挑取單菌落劃線純化。獲得一株產(chǎn)白色氣絲菌株，其編號為EGI 80425。
[0021](2)經(jīng)培養(yǎng)篩選確定的擬諾卡氏菌sp.) EGI 80425 CGMCCN0.9969在ISP2瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的EGI 80425電鏡照片分別可見氣生菌絲及孢子絲和孢子鏈及孢子形態(tài)，該菌株的菌落表面干燥，扁平；氣生菌絲與機(jī)內(nèi)菌絲連接緊密；基內(nèi)菌絲呈黃白色或亮橘黃色，發(fā)達(dá)、不分隔；氣生菌絲為白色，發(fā)育良好，孢子表面光滑。
[0022]同時，本發(fā)明具體提供一種利用擬諾卡氏菌生產(chǎn)安莎霉素P-3及其15-羥基衍生物中的應(yīng)用，具體的利用擬諾卡氏菌sp.) EGI 80425生產(chǎn)制備安莎霉素P-3 {.Ansamitocin P_3)及其15-輕基衍生物的方法步驟如下:
Cl)制備發(fā)酵菌種:將菌株EGI 80425接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述的種子培養(yǎng)基按質(zhì)量/體積百分比計算，含酵母提取物0.4%，葡萄糖0.4%，麥芽提取物(膏)1.0%，微量鹽(1X) 100 yL, pH 7.2-7.4。
[0023](2)利用上述得到的種子發(fā)酵生產(chǎn)安莎霉素P-3及其15-羥基衍生物:將培養(yǎng)后的種子按體積比1:20-1:9的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)120-240小時，得到含安莎霉素P-3及其15-羥基衍生物的菌株擬諾卡氏菌EGI 80425的發(fā)酵培養(yǎng)物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分及制備方法同種子培養(yǎng)基。
[0024](3)從發(fā)酵產(chǎn)物中提取分離安莎霉素P-3和及其15-羥基衍生物:將發(fā)酵液離心，所得上清液用乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，菌絲體用丙酮反復(fù)萃取3次，萃取液減壓濃縮后得到粗提物；采用正相柱層析，上清液粗提物用氯仿/甲醇體系梯度洗脫，共得到8個組分25-Α1~Α8，菌絲體粗提物用氯仿/甲醇體系(10:0-5:5)梯度洗脫，共得到5個組分25-Bl~B5o HPLC分析得到主要產(chǎn)物有兩個，存在于組分25-A2與25-B2中，經(jīng)TLC驗證后再將25-A2進(jìn)行正相柱層析、氯仿/甲醇梯度洗脫，共得到15個組分25A2-1~A2-15，經(jīng)HPLC分析結(jié)合TLC驗證后合并為25A2-6、25A2-7、25B2，再以半制備HPLC (乙腈/水55%_75%線性洗脫 20min，流速 2.5ml/min)分離，得到化合物 25B (Ansamitocin P-3)。合并 25A2-8、25A2-9，以半制備HPLC (乙腈/水30%-100%線性洗脫18min，流速2.5ml/min)分離，得到化合物 25C (15-Hydroxyansamitocin P_3)0
【附圖說明】
[0025]圖1 所示為擬諾卡氏菌(yVocari/1Asis sp.) EGI 80425 CGMCC N0.9969 在 ISP2瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的電鏡照片。
[0026]圖2 所示為擬諾卡氏菌(yVocari/1Asis sp.) EGI 80425 CGMCC N0.9969 的 16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
[0027]圖3所示為安莎霉素P-3 (A)及15-羥基安莎霉素P_3 (B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0028]圖4 所示為擬諾卡氏菌(yVocari/1Asis sp.)EGI 80425 CGMCC N0.9969 發(fā)酵產(chǎn)生安莎霉素P-3 (2)及15-羥基-安莎霉素P-3 (I)的HPLC圖譜。
[0029]圖5所示為安莎霉素P-3的核磁碳譜和氫譜數(shù)據(jù)圖。
[0030]圖6所示為15-羥基-安莎霉素P-3的核磁碳譜和氫譜數(shù)據(jù)圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，當(dāng)然，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0032]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設(shè)備:
培養(yǎng)基選用:馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(PDA)、酵母膏-麥芽膏瓊脂(ISP2)、燕麥瓊脂(ISP3)和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、無機(jī)鹽淀粉瓊脂(ISP4)、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基(ISP5)、察氏瓊脂、高氏一號、PDA和NA培養(yǎng)基等都是本領(lǐng)域可知悉的培養(yǎng)基可供選擇。
[0033]主要儀器與試劑:MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，Sff-CJ-1FB型單人雙面凈化工作臺，E360K離心機(jī)，恒溫?fù)u床HWY-1OOqPCR儀Eppendorf No:5345,電泳儀 B1-Rad Mode 200/2.0，凝膠成像儀 United-B1，GK-330C plus，PCR 預(yù)混液(TaKaRaB1technology)，其余試劑均為分析純。Xseries II型電感親合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)，美國THERMO公司；SeVen Easy Plus S20P型精密pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THZ_82氣浴恒溫振蕩箱，江蘇金壇誠輝儀器廠；GMSX-280壓力蒸汽滅菌器，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司。試劑均為分析純，水為超純水，18.2 ΜΩ.cm。
[0034]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0035]實施例一:擬諾卡氏菌(yVocari/1Asissp.) EGI 80425 CGMCC N0.9969的分離、培養(yǎng)、鑒定
1.菌株分離:
土樣采自準(zhǔn)噶爾盆地天然高鹽堿地，土樣采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室保藏于4°C ;稱2g 土樣于18 mL無菌水中進(jìn)行梯度稀釋，取200 μ L 10 — 6、10 — 7稀釋液涂布于 ISP2 平板上(培養(yǎng)基成分(g/L):yeast extract 4.0，malt extract 4.0，glucose 10.0,NaCl 30 ；trace salts I mL，純水 1000 mL ;滅菌結(jié)束后用 10 N NaOH將pH調(diào)至10.0)，于37 V培養(yǎng)3周后，挑取單菌落劃線純化，獲得一株產(chǎn)白色氣絲菌株，其編號為 EGI 80425。
[0036]2.菌株形態(tài)學(xué)特征:
菌落干燥，較緊密，扁平；基內(nèi)菌絲與氣生菌絲結(jié)合緊密不易挑起，中后期產(chǎn)生孢子，孢子易挑?。换鶅?nèi)菌絲呈黃白色或亮橘黃色，發(fā)達(dá)、不分隔；氣生菌絲為白色，發(fā)育良好，孢子表面光滑，參見附圖1可知，在ISP2瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的EGI 80425