2h，得到增菌液；
[0035] 2.增菌液振蕩混勻后取I. 5ml增菌液至離心管中，lOOOr/min離心Imin去除食品 碎片，取上清l〇〇〇〇r/min離心10min，棄上清，用無菌去離子水重懸沉淀，10000r/min離心 lOmin，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴lOmin，冰浴lOmin，取上清液，得樣 品模板DNA ;
[0036] 3.將試劑盒中的PCR反應(yīng)預(yù)混液等置于冰上融化后，取PCR反應(yīng)預(yù)混液20 μ 1置 于PCR反應(yīng)管中，再加入模板DNA 5ul，用移液器吹打混合均勻；按照樣品DNA的PCR反應(yīng) 管制備方法依次制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應(yīng)管；陰性對照品的PCR反應(yīng)管中 的模板DNA用試劑盒中的陰性對照品代替，陽性對照品的PCR反應(yīng)管中的模板DNA用試劑 盒中提供的陽性對照品代替；每擴增一次都要至少有一管陰性對照和一管陽性對照。
[0037] 4. PCR反應(yīng)管制備好之后置于PCR儀上進行擴增，具體反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s、51. 2°C退火 30s、72°C延伸 75s，30 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0038] 5. PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2_5ul PCR產(chǎn)物進行電泳，紫外燈下觀察檢測結(jié)果。
[0039] 圖1到圖5中，M :250 bp DNA分子量標(biāo)準；陽：陽性對照；陰：陰性對照；檢：被檢 測樣品。
[0040] 如圖1所示，陽性對照有2條大小分別為1164bp和544bp的條帶，陰性對照只有 1條大小為1164bp的條帶，說明檢測成功。
[0041] 如圖2所示，陽性對照有2條帶，陰性對照有1條帶，樣品孔中沒有條帶，說明提取 的DNA中含有酶抑制劑，建議去除可能的抑制因素后重新進行PCR檢測。
[0042] 如圖3所示，陽性對照和陰性對照都有2條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉 污染，結(jié)果不可靠，建議重新進行PCR檢測。
[0043] 如圖4所示，陽性對照有2條帶，陰性對照沒有1條帶，樣品孔只有1條約1164bp 的條帶，結(jié)果呈陰性，說明樣品中沒有蠟樣芽孢桿菌。
[0044] 如圖5所示，陽性對照有2條帶，陰性對照有1條帶，樣品孔有2條帶，說明被檢樣 品呈陽性，樣品中有蠟樣芽孢桿菌污染。
[0045] 以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何 熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護范圍為準。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的試劑盒，其特征是： 該試劑盒包含：無菌去離子水，PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶、DNA染料溴化乙錠、溴酚藍 上樣緩沖液、對照品； 所述PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、脫氧核糖核苷三磷酸、檢測用引物、擴增 內(nèi)標(biāo)對照、DNA染料； 所述檢測用引物為如下4條引物的混合物： A ：AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG B ：CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC C：GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG D ：CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG 所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品為引物C和引物D為引物進行 PCR擴增后得到的擴增產(chǎn)物的重組質(zhì)粒，其擴增序列見序列表SEQ ID No.6。陽性對照品為 以引物A和引物B為引物進行PCR擴增后得到的擴增產(chǎn)物的重組質(zhì)粒，其擴增序列見序列 表SEQ ID No. 5,以及以引物C和引物D為引物進行PCR擴增后得到的擴增產(chǎn)物的重組質(zhì) 粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的試劑盒，其特征是：構(gòu)建擴增 產(chǎn)物的重組質(zhì)粒時，將擴增產(chǎn)物克隆至PMD 19 (simple) -T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOPlO感 受態(tài)細胞，PCR陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證目的基因正確無誤。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是： 具體步驟是： (a) 樣品的米集：無菌米集可疑食品； (b) 增菌培養(yǎng)：將采集可疑食品進行無菌取樣，放入無菌研缽或者組織研磨器內(nèi)勻漿， 加入無菌LB培養(yǎng)基，得增菌液； (C)DNA提取：取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻后，離心，棄上清，用無菌生理鹽水重懸沉 淀，離心，棄上清，生理鹽水重懸沉淀，沸水浴，冰浴，離心，取上清液，得樣品模板DNA ; (d) PCR反應(yīng)管制備：PCR反應(yīng)管的制備及PCR反應(yīng)液的融化置于冰上進行； 依次取PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶、樣品模板DNA加入至PCR反應(yīng)管中混合均勻，制 得樣品模板DNA的PCR反應(yīng)管；按樣品DNA的PCR反應(yīng)管的制備方法依次制備陰性對照品 和陽性對照品的PCR反應(yīng)管； (e) 擴增檢測：將制備的樣品模板DNA、陰性對照品、陽性對照品和標(biāo)準品的PCR反應(yīng)管 置于PCR儀上，分別進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物； (f) 檢測結(jié)果判定：取瓊脂糖溶于電泳緩沖液，混合均勻后煮沸，冷卻，加入溴化乙錠， 傾倒凝膠板；凝膠冷卻凝固后，將PCR擴增產(chǎn)物與等量溴酚藍上樣緩沖液，加入凝膠孔中進 行電泳；電泳結(jié)束后，陽性對照的凝膠孔有2條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔只有1條帶， 貝IJ PCR反應(yīng)檢測成功；被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔相應(yīng)條帶大 小一致，判定為陽性，反之，為陰性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：進行增菌培 養(yǎng)時，無菌取樣質(zhì)量為9g，LB培養(yǎng)基50ml，培養(yǎng)時間為8h~12h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：所述LB培養(yǎng) 基是采用蛋白胨l〇g、氯化鈉l〇g、酵母提取物5g及蒸餾水1000ml，于pH為7. O狀態(tài)下，在 121<€高壓蒸汽滅菌2〇111；[11制得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：所述引物PCR 反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)液20 y I、Taq DNA聚合酶0. 2 y 1及樣品模板DNA 2 y 1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：進行PCR擴 增時，其反應(yīng)程序為：94°〇預(yù)變性41^11 ;941：變性308,51.21：退火308,721：延伸758，共30 個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：所述瓊脂糖 質(zhì)量為〇. 3g，電泳緩沖液的體積為30ml，溴化乙錠的濃度為0. 5 y g/ml，PCR擴增產(chǎn)物和溴 酚藍上樣緩沖液的體積分別為3 y 1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征是：電泳時，電場 強度為5V/cm，電泳時間為40min。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴增內(nèi)標(biāo)的PCR方法及試劑盒，與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)點是使用方便、可靠性好、檢測周期短、靈敏度高、特異性強、成本低廉、操作步驟簡單，適用于高通量操作、標(biāo)準化操作，對提高食品安全具有重要意義。所述方法包括：(1)利用primer premier 6.0軟件設(shè)計針對蠟樣芽孢桿菌的一對特異性引物A/B和一對擴增內(nèi)標(biāo)引物C/D；(2)采集可疑樣品進行增菌培養(yǎng)，提取DNA后，A/B和C/D兩對引物、擴增內(nèi)標(biāo)模板、檢測樣品DNA共同進行擴增；(5)取試劑盒的PCR反應(yīng)預(yù)混液配置25ul反應(yīng)體系進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察檢測結(jié)果。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-085, C12Q1-04
【公開號】CN104862399
【申請?zhí)枴緾N201510267524
【發(fā)明人】勵建榮, 張德福, 張明, 付緒磊, 湯軼偉, 高雪, 徐永霞, 劉秀英, 劉雪飛, 趙麗紅, 李春
【申請人】渤海大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月21日